蛋白质羰基含量测定说明书

注意：正式实验之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。

测定原理：

羰基与2,4-二硝基苯肼反应生成红色2,4-二硝基苯腙，在370nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂 0.1g×5 支，4℃避光保存。（使用前根据样品数，每支加1mL水溶解，每支为10个样品用量）

试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。

试剂六：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。

样品处理：

1. 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆，于4℃，4000g 离心10min，取上清，加入0.1mL试剂一，室温放置 10min，4℃，10000g 离心10min，取上清待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500 万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体样本：直接测定。

测定步骤和操作表：

1、分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长至370nm。

2、操作表

计算公式：

a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 按照样本蛋白浓度计算

蛋白质羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(V 样×Cpr)

 =0.227×ΔA 370 ÷Cpr

2. 按照样本重量计算

蛋白质羰基含量（μmol/g）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(W ×V 样÷V 样总)

=0.227×ΔA 370 ÷W

3. 按照细胞数量计算

蛋白质羰基含量（μmol/10⁴cell）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样总)=0.227×ΔA 370 ÷细胞数量

4. 按照液体体积计算

蛋白质羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷V 样=0.227×ΔA 370

V 反总：反应体系总体积，0.3 mL；ε：羰基毫摩尔消光系数，22 L/mmol/cm；d：比色皿光

径，1cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，W：样本质量，g

b．用96孔板测定的计算公式如下

1. 按照样本蛋白浓度计算

蛋白质羰基含量（μmol/mg prot）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(V 样×Cpr)

=0.454×ΔA 370 ÷Cpr

2. 按照样本重量计算

蛋白质羰基含量（μmol/g）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(W ×V 样÷V 样总)

 =0.454×ΔA 370 ÷W

3. 按照细胞数量计算

蛋白质羰基含量（μmol/10⁴cell）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样总)=0.454×ΔA 370 ÷细胞数量

4. 按照液体体积计算

蛋白质羰基含量（μmol/mL）= [ΔA370×V 反总÷（ε×d）]÷V 样=0.454×ΔA370

V 反总：反应体系总体积，0.3 mL；ε：羰基毫摩尔消光系数，22 L/mmol/cm；d：96 孔板光

径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，W：样本质量，g

注意事项：

1. 试剂一使用前根据要测定的样品数现配，配置好后 4℃保存，若变为黑色，则不能使用。

2. 试剂二见光易分解，反应需严格避光。