免疫组化遇到的问题及其解决办法
1、染色过强
原因 | 解决办法 |
抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长 | 降低抗体滴度(一般指浓缩性抗体)抗体孵育时间:室温1小时或4℃过夜 |
孵育温度过高,孵育温度超过37℃ | 一般室温20-28℃ |
DAB显色时间过长或DAB浓度过高 | 显色时间不能超过5-10分钟,以显微镜下观察为准 |
2、非特异性背景染色
原因 | 解决办法 |
操作过程中冲洗不充分 | 每步冲洗3×5 |
组织中含过氧化物酶未阻断 | 可再配置新鲜3%H2O2封闭,孵育时间延长 |
组织中含内源性生物s | 正常非免疫动物血清再封闭 |
血清蛋白封闭不充分 | 延长血清蛋白封闭时间 |
3、染色弱
原因 | 解决办法 |
抗体浓度过低,孵育时间过短 | 提高抗体浓度,孵育时间不能少于60分钟 |
试剂超过有效使用期 | 及时更换试剂 |
操作中,滴加试剂时缓冲液未沥干,致使试剂稀释 | 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液(但防止切片干燥) |
室温太低,低于15℃ | 若室温低于15度,要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟(或4℃冰箱过夜) |
蛋白封闭过度 | 封闭时间不要超过10分钟 |
4、染色阴性
原因 | 解决办法 |
操作步骤错误 | 重新试验,设立阳性对照 |
组织中无抗原 | 设立阳性对照片,以验证实验结果 |
一抗与二抗种属连接错误 | 仔细确定一抗与二抗种属无误 |
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