古朵分析实验技巧 | ELISA 高背景的原因分析

　　ELISA 实验过程中常常出现让人难以琢磨的结果。其中阴性对照出现高背景的情况也时有发生，这样导致结果不那么可信。出现高背景的原因可能如下。

　　1. 抗体、抗体的浓度不合适

　　抗体质量不好，特异性不高可能会与封闭液(BSA)产生交叉反应，可以用 0.8% 的明胶代替，本底就很好了。

　　抗体亲和力不好，也会如此，由于加大了抗体的使用量，必然造成了非特异性增加的可能。

　　2. 封闭液成分、封闭液的浓度、封闭时间

　　封闭液，如 BSA 可能与抗体发生交叉反应，导致背景偏高。

　　封闭液的浓度偏低，封闭时间过短，导致封闭不*，抗体与酶标板孔结合，也可能导致背景偏高。

　　3. 孵育时间、孵育温度

　　孵育时间过长 、温度过高，也可能会导致非特异性结合增加，从而造成本底增高。

　　4. 洗板液成分、洗板的时间

　　一般用 PBS 洗板就可以了，但有时候可以在洗板液中加入一些表面活性剂，如 tween-20。

　　洗板的时间不足，会导致抗体残留，引起阴性对照显色。如果是机洗，可以改为手洗少量尝试，增加洗板时间。机洗一般没有手洗去除干净。

　　5. 显色时间

　　由于系统优化不好，导致样品显色较弱，而延长了显色时间，这样一来导致阴性对照也有部分显色。此时，应该优化检测系统，调整包被物、检测抗体、底物等的浓度，缩短显色时间，显色一般不超过 15 min。

　　6. 样品

　　样品中含有干扰物质。此时可以优化系统，调整其他检测抗体的比例，而增加样品的稀释度、增加洗脱步骤等。

　　7. ELISA 板的选择

　　聚苯乙烯制备的 ELISA 板经射线照射后，其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加，应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增多，但用于间接法测抗体时空白值较大。

　　与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为 ELISA 固相载体的一种，聚氯乙烯的特点为质软板薄，可剪割，价廉，但光洁度不如聚苯乙烯板，孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。

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