WB 是实验室常见实验之一，蛋白定量后，上样之前，还需要哪些步骤制样呢？

1. 蛋白含量测定后，古朵生物建议大家把各个样品稀释到某一固定浓度（稀释可使用 PBS，水或裂解液），等体积等质量上样，计算上样体积时需包含 loading buffer 的体积。

例如：把所有蛋白浓度都稀释到 2ug/ul，然后与 2Xloading buffer 1:1 混合后，浓度成为 1ug/ul，建议上样 20-30ul 即可。

2. 与 loading buffer 混匀后，要将样品在沸水中煮 3-5 分钟，使蛋白充分变性。也可使用 PCR 仪 95°加热 5 分钟。

PS：煮沸并非必须步骤，有些蛋白仅需 70℃ 煮或无需煮沸，具体请参照抗体要求操作。

3. 煮沸后在冰上静置少许时间后进行低速离心，即可上样。剩余样品建议分装后保存，样品可以在 4℃ 冰箱短时间保存，也可以在-20 或-80℃ 保存，解冻后可重新煮沸上样。


SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中样品为什么要加 loading buffer？

loading buffer 的功能，第一，含有指示剂溴酚蓝和二甲苯氰 FF 起到指示的作用，显示电泳的进程，以便我们适时终止电泳；第二，成分中的甘油可以加大样品密度，使样品密度大于 Tris   或者其他缓冲液，从而沉降到点样孔中，防止样品飘出点样孔；第三，loading buffer 中 SDS 是比较强的阴离子表面活性剂，与蛋白质表面结合，覆盖蛋白质本身的电荷性质，使之表面带负电荷。SDS 还可以破坏维持蛋白质高级结构的重要因素--疏水键，使蛋白质解构。2-ME 和 DTT 是比较强的还原剂，可以打开蛋白质分子内和分子间的二硫键, 使蛋白质亚基分离。

上样之前煮沸的目的是什么？

煮沸样品的目的是为了更好地将蛋白质的高级结构打开。在温度高时，一方面维持蛋白质高级结构的各种作用力减弱，另一方面促进 SDS 的电荷覆盖和疏水键打开作用。通过上样 buffer 和加热的处理，蛋白样品呈现带负电荷的长链（还原电泳），在电泳时的分子筛效应使得泳动只和蛋白质大小有关（也就是表观分子量），与蛋白形状无关。