蛋白过镍柱纯化的原理：Ni-NTA 纯化介质纯化带有 His6-Tag 的融合蛋白是目前蛋白纯化中常使用的一种方法。Ni 柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有 HIs(组蛋白) 标签的碱性蛋白蛋白结合，组蛋白标签一般是 6 个组氨酸 (碱性氨基酸)。在蛋白上样后，带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里，其他的杂蛋白流出。Ni 柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合，采用咪唑洗脱，咪唑竞争性结合到硫酸镍上，目的蛋白就被洗脱了，这时候收集穿出液，里面就是目的蛋白，然后透析掉咪唑即可。 上样，清洗，洗脱，基本三个步骤就结束了。

Ni-NTA 常见问题及建议

1. His 标签蛋白没有与柱结合：

a. 可能原因：超声的功率不对 ( 太大，蛋白炭化，太小，蛋白没有释放)。 解决方法：改变超声功率，并在超声前加入溶菌酶。

b. 可能原因：样品或者是结合缓冲液不正确。 解决方法：检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。

c. 可能原因：组氨酸标签暴露不*。 解决方法：在变性条件下 ( 用 4-8 M 脲，或 4-6 M 盐酸胍) 进行纯化。

d. 可能原因：His 标签丢失。 解决方法 1：WB 检查 His 是否表达，上游构建，改变 His-tag 的位置 (C- 端或 N- 端)，必要时增加 His 个数。 解决方法 2：孵育的时间不够，降低流速和增加孵育的时间。

解决方法 3：改变螯合的金属离子，寻找到*的结合金属离子。 Ni2+ 通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数 6×His 标记的重组蛋白质的shou选金属离子。也是一般常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响，包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH，因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。 2. His 标签蛋白没有被洗脱下来：

a. 可能原因：洗脱条件太温和 （组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上，结合力较强）。 解决方法：增加咪唑的梯度洗脱或降低 pH 来找出*的洗脱条件。

b. 可能原因：降低 pH 的方法洗脱的，若 pH 低于 3.5，会导致镍离子脱落。 解决方法：改变洗脱办法，咪唑竞争性洗脱。

c. 可能原因：蛋白已沉淀在柱上。 解决方法： 减少上样量，或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变 NaCl 的浓度，或在变性条件 ( 去折叠) 下洗脱 ( 用 4～8 M 脲，或 4～6 M 盐酸胍)。

d. 可能原因：非特异性疏水或其他相互反应。 解决方法：加非离子去污剂到洗脱缓冲液 (如：2% Triton X-100) 或增加 NaCl 的浓度。 3. His 标签蛋白洗脱后杂带较多