重组质粒的筛选是质粒构建的重要步骤，重组子是筛出来的，这个命题没有问题。问题是关键步骤不在筛选。影响重组质粒构建效率的关键步骤在于酶切，不管是否是定向克隆还是非定向克隆。酶切的关键在于切干净，*的酶切反应是成功的一半，尤其是载体的酶切。

1）  酶切反应的前提是对质粒载体的大致定量，一般大小的质粒（3－5kb）一次连接的用量在100ng左右，一般挖胶回收的损失在50%左右，为保证一次酶切反应可以进行至少三次连接，质粒载体的量在1微克左右较合适。太多的载体用量对酶切效率有负面影响，而太少的质粒载体不能保证实验的需要。

2）  然后使用过量2倍以上的酶量进行反应（按照酶切时间一小时计算，酶活性单位的定义可以参见公司的目录，一般一个单位的定义是指推荐条件下消化1微克的lambda DNA所需的酶量），反应时间2小时——过夜（不要超过10小时）。我们实验室一般采用较长的酶切时间，没有遇到过问题，但是也有实验室酶切时间控制较严格。但是原则是质粒载体一定要酶切*。

3）  挖胶回收，现在很多的国产试剂盒可以保证50％以上的回收效率。采用低熔点胶或电洗脱也是很多实验室的选择。

4）  连接，关键点是载体和片断的比例以及用量。对于定向克隆片断与载体的摩尔比一半大于2，非定向克隆一般大于5－10。一般大小的质粒载体（3－5kb）一次连接的用量在100ng左右。胶回收后建议对载体和片断进行定量。连接反应我们一般使用NEB的连接酶或Takara的ligation 试剂盒，这两种产品允许快速连接。其它很多公司的普通连接酶也不错。

5）  在影响克隆效率的诸多因素中酶切效率是为关键的步骤，因为酶切不*导致的空载体背景是绝大多数克隆操作失败的原因，极少数酶切反应不*的产物可能在转化后形成非常高的空载体背景。对于非定向克隆来说，碱性磷酸酶消化是另一非常关键的步骤，但是这也是在建立在酶切反应*的前提之下。
重组子筛选时，对于定向克隆我们一般挑取的菌斑数为4个，对于非定向克隆，我们一般挑取8个，如果筛不到重组子，我们一般从酶切载体开始重做，因为我们发现，4－8个菌落中挑不到重组子时，继续筛选所费的努力通常得不偿失。