基本方法（一）用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。
2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O•D值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔O•D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。
基本方法（二）用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。
加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,后一遍用DDW洗涤。
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。
ELISA常用的四种方法
1．直接法测定抗原 :将抗原吸附在载体表面；加酶标抗体，形成抗原—抗体复合物；加底物。底物的降解量＝抗原量。
2．间接法测定抗体:将抗原吸附于固相载体表面；加抗体, 形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。 测定底物的降解量＝抗体量。
3．双抗体夹心法测定抗原:将抗原免疫种动物获得的抗体吸附于固相表面;加抗原，形成抗原-抗体复合物;加抗原免疫第二种动物获得的抗体，形成抗体抗原抗体复合物;加酶标抗抗体（第二种动物抗体的抗体）; 加底物。底物的降解量＝抗原量。
4. 竞争法测定抗原:将抗体吸附在固相载体表面;加入酶标抗原；加入酶标抗原和待测抗原；加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。
