Caspase-1活性分析方案：艾美捷FAM-FLICA试剂盒解决方案

艾美捷FAM-FLICA Caspase-1 (YVAD) Assay Kit FAM-FLICA Caspase-1 活性分析试剂盒检测方案：

1、凋亡诱导：

在开始实验之前，确定可重复的方法用于通过触发胱天蛋白酶活性获得阳性对照。此过程随每个细胞系而显著变化。例如，细胞凋亡可能是用2-4µg/mL喜-树碱或1-2µM星形孢霉素诱导>4小时。  

2、焦下垂诱导：

最佳的焦下垂/胱天蛋白酶-1诱导方案将有显著差异在细胞系之间。在开始实验之前，确定获得caspase-1阳性对照的可重复方法。例如在细胞培养基中使用5-10ng/mL肉豆蔻酸佛波酯（PMA）12-24小时（直到细胞粘附），然后暴露于100 ng/mL脂多糖（LPS）和5mM三磷酸腺苷（ATP）混合24小时。或者，在37°C下，在1-20µM的细胞培养基中使用尼格瑞金，可在细胞中诱导2-24小时。每个研究者应调整Nigericin的浓度和治疗期，以适应特定的细胞系和研究条件。

3、FLICA的制备：

FLICA以冻干粉形式提供小瓶内的虹彩光泽。避免光线照射，并在以下情况下使用手套处理。因为必须立即使用30X FLICA溶液，所以在染色前准备好。1.用50µL DMSO重新配制每小瓶FLICA，形成150X股-票储备溶液应为无色至黄色或橙色。一旦复原，可将其储存在≤-20°C，保护6个月在此期间解冻不超过两次。2.在加入样品和对照品之前，立即稀释通过向每个小瓶中添加200µL PBS，形成30X FLICA 1:5解决方案在稀释到水溶液中30分钟内使用30X FLICA

缓冲区。

4、1X凋亡洗涤缓冲液的制备：

ICT的细胞凋亡洗涤缓冲液（目录#634和#635，AWB）是一种等渗溶液，用于在暴露于FLICA后洗涤细胞。它含有哺乳动物蛋白质，可稳定用FLICA染色的细胞和叠丨氮化钠细菌生长（1X凋亡洗涤缓冲液含有0.01%w/v钠叠丨氮化物）。可以使用含有FBS和其他添加剂的细胞培养基以洗涤细胞而不是细胞凋亡洗涤缓冲液。

10X细胞凋亡洗涤缓冲液在冷藏期间可能形成沉淀。如果发生这种情况，轻轻加热，直到所有晶体溶解。不要煮沸。

在diH2O中以1:10稀释10X凋亡洗涤缓冲液。例如，添加15mL 10X细胞凋亡洗涤缓冲液至135mL diH2O，总共150mL。

•1X凋亡洗涤缓冲液可储存在2-8°C，或冷冻并在6个月内使用。

图：Jurkat细胞用阴性对照DMSO（左）或凋亡诱导剂星孢霉素（右）处理4小时，然后用ICT染色绿色聚半胱天冬酶抑制剂探针FAM-VAD-FMK（试剂盒#92）1小时。细胞洗涤两次并在流式细胞仪上读取。阴性对照仅在3.3%的细胞群中表现出半胱天冬酶活性（P3，左侧直方图），而星孢霉素治疗诱导的caspase活性为94.8%（P3，右直方图）。这是28:1的比率。数据特蕾西·墨菲女士提供，ICT，10G5。

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析试剂盒组分：

The test size kit contains:

• 1 bottle of FAM-FLICA cystatin reagent

• 1 bottle of 10X apoptosis washing buffer (15 mL), # 635

• 1 bottle of fixative (6 mL), # 636

• 1 vial of iodopropyl, 250 µ g/mL (1 mL), # 638

• 1 vial Hoechst 33342200 µ g/mL (1 mL), # 639

The standard size kit contains:

• 4 bottles of FAM-FLICA cystatin reagent

• 1 bottle of 10X apoptosis washing buffer (60 mL), # 634

• 1 bottle of fixative (6 mL), # 636

• 1 vial of iodopropyl, 250 µ g/mL (1 mL), # 638

• 1 vial Hoechst 33342200 µ g/mL (1 mL), # 639.

将未开封的套件和每个未开封的组件储存在2-8°C，直到到期日期。一旦用DMSO重新配制，立即使用FLICA，或在≤-20°C的温度下储存6个月，避光，解冻时间不超过在这段时间内两次。

艾美捷Immunochemistry Caspase-1活性分析试剂盒实验准备:

用FLICA染色细胞可以在几个小时内完成。然而FLICA用于活细胞，需要定期维护和提前几天栽培。此外，一旦正确的数字已经培养了个细胞，必须为实验分配时间治疗或半胱天冬酶激活过程。创建细胞群，例如：

a、 暴露于实验处理的细胞

b、 接受安慰剂的阴性对照细胞群治疗

当FLICA检测到催化活性形式的胱天蛋白酶时酶，计划实验，以使FLICA在细胞中预期胱天蛋白酶被激活时被稀释和给药。30X FLICA的推荐体积为每300µL细胞10µL3-5 x 105细胞/mL，但数量可能因实验而异条件和用于分析的仪器。每位研究者应调整FLICA的量以适应特定细胞系研究条件。

将细胞培养至适合特定实验条件的最佳密度或凋亡诱导方案。细胞密度不应超过106细胞/

超过此浓度培养的细胞可开始自然生长进入凋亡。可能需要进行初步实验来确定何时以及使用多少FLICA作为产生的正信号是培养过程中caspase活性的直接测量时期.