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小肠结肠炎耶尔森氏菌(YE)核酸检测试剂盒方法个标准品的OD值减去空白孔的OD值后作图，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘出标准曲线。亦可以OD值为横坐标，标准品的浓度为纵坐标，绘出标准曲线。
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小肠结肠炎耶尔森氏菌(YE)核酸检测试剂盒方法1、什么是定量PCR？
以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。
2、定量PCR定量的理论依据是什么？
特定的待扩增基因片段起始含量越大，则指数扩增过程越短，当扩增速率趋于稳定后，则无论原来样品中起始模板含量多少，终扩增片段的含量通常是一样的。
理想的扩增结果：Y=X×2n 其中Y代表扩增产物量， X代表PCR反应体中的原始模板数 n为扩增次数；理论上PCR扩增效率为*，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一次复制都不*，即每一次扩增中，模板不是呈2的倍增长；实际应为：Y= X(1+E)n ，其中E 代表扩增效率：E = 参与复制的模板/总模板，通常E≤1，E在整个PCR扩增过程中不是固定不变的。通常X 在 1～105拷贝、循环次数n≤30时，E 相对稳定，原始模板以相对固定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；随着循环次数n的增加（>30次），E值逐渐减少，Y 呈非固定的指数形式增加，后进入平台期。
3、荧光定量PCR定量的理论模式又是什么？
PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量PCR方法，即荧光定量PCR。
PCR扩增通式： ① Tn=T0（1+E）n
② Tn=Tn-1（1+E）n 注：[0
其中E表示扩增效率，n为循环数，Tn表示在n个周期后PCR产物的数量，Tn-1表示在n-1个周期后PCR产物的数量，T0为原始模板数量。设定PCR到达指数扩增期时，产生一定的荧光(荧光依赖于某一循环扩增产物的总量，即特定的拷贝数K，为常数，大约在1010左右)高于背景为仪器所识别，此时的循环数为CP（crossing point）,也就是K= T0（1+E）CP，取对数即：
lg K=lg T0+CP*lg(1+E)
CP=- 1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E)
由于对一特定的PCR而言，E与K均为常数，故上式为循环数（CP）对原始模板拷贝数的对数（lg T0）一次方程，其标准形式y=kx+b,该直线的斜率为- 1/lg(1+E)，在横坐标上的截距为lgk/lg(1+E)，也是荧光定量PCR所谓的标准曲线。例如下图为单管实时荧光定量RT-PCR的标准曲线：
小肠结肠炎耶尔森氏菌(YE)核酸检测试剂盒方法目前荧光定量PCR均采用外标定量
外标法定量PCR扩增效率的计算，由于标准曲线的斜率(Slope)为- 1/lg(1+E)，可知E=10-1/Slope-1 ,如从标准曲线中知道Slope=-3.337,则可推知扩增效率E=101/3。337-1=0.99,也有作者将(1+E)直接视为扩增效率E，则E=10-1/Slope，求得的E值均在1—2之间，有时也有大于2的结果，如下图所示。另外也可直接根据系列稀释外标在该次实时荧光PCR的结果来大略分析扩增效率的高低，例如系列10倍稀释外标在PCR扩增时有N2=N0En2, N3=(10*N0)En3,在扩增到指数期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝数相同，即N2=N3，En2-n3=10,取对数得到⊿ngE=1, E=101/⊿n，E=2，⊿n=3.32; E=1.8，⊿n=3.91.反之亦然。
根据PCR扩增过程中是否加入某种标记物、标记物的种类以及后检测的信号的不同可分为四种类型：①直接定量检测法， ②同位素标记定量，③酶标记定量检测法，④荧光定量PCR技术
荧光定量PCR 主要原理发射波长与受体荧光染料光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光，同时将供体荧光淬灭。SYBR Green I 检测模式
SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光大增强。因此， SYBR Green I的检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的大吸收波长约为497nm，发射波长大约为520nm。PCR扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40个循环。
SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本所以在临床上使用可能会有假阳性发生。 SYBR Green I的优点：SYBR Green I的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链DNA相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。
5、为什么要用荧光定量PCR技术进行定量？它与传统的定量PCR有什么不同？
如前所述的，传统的定量PCR有很多，主要是倍比稀释法、内参照法、竞争法、PCR-ELISA法，但这些定量PCR技术的难点主要在于：（1）如何确定PCR正处于线性扩增范围内（只有在此范围内PCR产物信号才与初始模板的拷贝数成比例）。（2）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个合适的方法检测结果。为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的cDNA或者对每个基因的扩增循环数作适当的调整；有的研究者加一个竞争性模板，有的做限制性的稀释梯度分析，或者加一个PCR模拟（mimic）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增，而扩增产物的检测通常在跑胶以后通过染料、放射活性或者探针进行检测。（3）大多数是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异（如下图所示），因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量；虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法，所以传统定量PCR的缺点是：劳动强度大、定量不准确、重复性差。
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小肠结肠炎耶尔森氏菌(YE)核酸检测试剂盒方法PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；刚开始时, 探针结合在DNA任意一条单链上;PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成*同步。
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