免疫沉淀的影响因素
免疫沉淀的成功依赖于抗原的纯度以及制备抗体的难易，主要受两方面因素的影响:1、抗原原液的丰度，2、抗体对抗原的亲和力。
有3种类型的抗体可用于免疫沉淀:多克隆抗体，混合单克隆抗体和单克隆抗体。
步：为什么要做免疫沉淀呢？
IP是许多蛋白质相关研究的重要步骤，用于研究蛋白质的存在、相对丰度、蛋白表达的上下调、蛋白至稳定性及相互作用等。
（传统IP原理图）
总结：
IP的整个过程我需要用到的关键工具有：
一抗：选择能与我的样本发生反应，能做IP实验的一抗；
选择指南:
BMR20500 | PurKine™ Protein A Resin |
BMR20504 | PurKine™ Protein A Resin 4FF |
BMR20600 | PurKine™ Protein G Resin |
BMR20604 | PurKine™ Protein G Resin 4FF |
BMR20704 | PurKine™ Protein A/G Resin 4FF |
第二步：发现竟然没有合适的一抗来满足我需要做的免疫沉淀？
某些目的蛋白因为没有对应的特异性抗体而无法进行免疫沉淀，如抗体所识别的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽，无法与目的蛋白相互作用或抗体选择不合适，所选抗体不能识别处于天然构象的蛋白等，可以采用一个表位标记蛋白后，再选择针对此表位的标签抗体来进行免疫沉淀。厂家会推出一些常见的标签抗体用于IP实验，涉及flag、HA、His、Myc等标签，以满足大多数客户的需求。
特别是琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体，能大限度优化免疫沉淀实验，节省时间和成本。
1）原理：省去了Protein A/G与抗原-抗体复合物结合的步骤，且解决了Protein A/G和抗体结合能力弱的问题。偶联抗体直接和目标蛋白结合后，通过离心或使用磁力架，将目标蛋白从细胞裂解液中分离出来。高特异性单克隆标签抗体可实现高产量和高纯度，稳定、预封闭的填料及特异性抗体减少了免疫沉淀过程中的非特异性结合。
（琼脂糖/磁珠偶联的标签抗体应用于IP）
2）选择指南：
A02010AGB | Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Agarose |
A02010MGB | Anti-DDDDK Tag Mouse Monoclonal Antibody (1B10), Magnetic Beads |
A02040AGB | Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Agarose |
A02040MGB | Anti-HA Tag Mouse Monoclonal Antibody (4F6), Magnetic Beads |
A02050AGB | Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Agarose |
A02050MGB | Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody (5C3), Magnetic Beads |
A02060AGB | Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Agarose |
A02060MGB | Anti-Myc Tag Mouse Monoclonal Antibody (2D5), Magnetic Beads |
第三步：免疫沉淀后WB (IP-WB)出现重链、轻链干扰，怎么办？
在免疫沉淀实验后的WB验证环节中，当使用常规的 Anti-IgG (H+L) 酶标二抗时，通常会出现对应免疫沉淀一抗变性后产生的重链（50kDa）和轻链（25kDa）两条带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时，就会受到这两条带的干扰。如何避免干扰，
方法一：选择只和重链或轻链反应的二抗。如果目标蛋白分子量小于30KD，为了避免抗体轻链的干扰，选择重链特异性二抗；如果目标蛋白分子量大于30KD，为了避免抗体重链的干扰，选择轻链特异性二抗；
选择指南：
A25012 | IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG LCS | 轻链特异性 |
A25022 | IPKine™ HRP, Mouse Anti-Rabbit IgG LCS | 轻链特异性 |
A25112 | IPKine™ HRP, Goat Anti-Mouse IgG HCS | 重链特异性 |
A25222 | IPKine™ HRP, Goat Anti-Rabbit IgG HCS | 重链特异性 |
“使用IPKine Mouse Anti-Rabbit IgG LCS 轻链特异性二抗检测NUP50蛋白的IP结果，解决重链干扰问题！ ” CAT #: A25022
方法二：选择WB一抗时，选择和IP用一抗不同的种属，避免IP一抗的干扰；
方法三：选择HRP直接偶联的WB一抗，省去二抗的步骤。
免疫沉淀三步击破，你掌握了吗？如有疑问，欢迎来撩！
