基础知识背景 — 什么是小G蛋白？
小G蛋白(Small G Protein)因分子量只有20—30KD而得名，同时具有GTP酶活性，小G蛋白家族成员在细胞信号通路中发挥分子开关的功能，参与调控很多生物学过程。小G蛋白的共同特点是，当结合了GTP时即成为活化形式，这时可作用于下游分子使之活化，而当GTP水解成为GDP时（自身为GTP酶）则恢复到非活化状态。这一点与G蛋白里的Gα类似，但是小G蛋白的分子量明显低于Gα。
在细胞中存在着一些专门控制小G蛋白活性的小G蛋白调节因子，有的可以增强小G蛋白的活性，如鸟苷酸交换因子（guanine nucleotide exchange factor, GEF）和鸟苷酸解离抑制因子（Guanine nucleotide dissociation Inhibitor, GDI），有的可以降低小G蛋白活性，如GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein, GAP）。
个被发现的小G蛋白是Ras，它是Ras基因的产物。小G蛋白的Ras超家族由超过150个成员组成，基于它们的序列同源性，被分成若干亚家族，例如Rho，Ras，Ran，Rab，Arf和Rad / Rem / Gem / Kir。
小G蛋白超家族成员及其相关功能：
Ras | 细胞增殖 | DIRAS1; DIRAS2; DIRAS3; ERAS; GEM; HRAS; KRAS; MRAS; NKIRAS1; NKIRAS2; NRAS; RALA; RALB; RAP1A; RAP1B; RAP2A; RAP2B; RAP2C; RASD1; RASD2; RASL10A; RASL10B; RASL11A; RASL11B; RASL12; REM1; REM2; RERG; RERGL; RRAD; RRAS; RRAS2 |
Rho | 细胞骨架的动力与形态 | RHOA; RHOB; RHOBTB1; RHOBTB2; RHOBTB3; RHOC; RHOD; RHOF; RHOG; RHOH; RHOJ; RHOQ; RHOU; RHOV; RND1; RND2; RND3; RAC1; RAC2; RAC3; CDC42 |
Rab | 膜转运 | RAB1A; RAB1B; RAB2; RAB3A; RAB3B; RAB3C; RAB3D; RAB4A; RAB4B; RAB; RAB5B; RAB5C; RAB6A; RAB6B; RAB6C; RAB7A; RAB7B; RAB7L1; RAB8A; RAB8B; RAB9; RAB9B; RABL2A; RABL2B; RABL4; RAB10; RAB11A; RAB11B; RAB12; RAB13; RAB14; RAB15;RAB17; RAB18; RAB19; RAB20; RAB21; RAB22A; RAB23; RAB24; RAB25; RAB26; RAB27A; RAB27B; RAB28; RAB2B; RAB30; RAB31; RAB32; RAB33A; RAB33B; RAB34; RAB35; RAB36; RAB37; RAB38; RAB39; RAB39B; RAB40A; RAB40AL;RAB40B; RAB40C; RAB41;RAB42; RAB43 |
Rap | 细胞粘附 | RAP1A; RAP1B; RAP2A; RAP2B; RAP2C |
Arf | 囊泡转运 | ARF1; ARF3; ARF4; ARF5; ARF6; ARL1; ARL2; ARL3; ARL4; ARL5; ARL5C; ARL6; ARL7; ARL8; ARL9; ARL10A; ARL10B; ARL10C; ARL11; ARL13A; ARL13B; ARL14; ARL15; ARL16; ARL17; TRIM23, ARL4D; ARFRP1; ARL13B |
Ran | 核运输 | RAN |
Rheb | mTOR途径 | RHEB; RHEBL1 |
RGK | | RRAD; GEM; REM; REM2 |
Rit | | RIT1; RIT2 |
Miro | 线粒体转运 | RHOT1; RHOT2 |
Ras蛋白主要参与细胞增殖和信号转导；Rho蛋白对细胞骨架网络的构成发挥调节作用；Rab蛋白则参与调控细胞内膜交通（membrane traffic），其他家族成员也在细胞信号通路中发挥着非常重要的作用。
因此，研究GTP酶（GTPase）的活化调控机制具有广泛而深远的生物学意义。
传统检测Rho 蛋白活化水平的方法主要为pull-down检测。pull-down法往往存在耗时长、需要样本量大、不太适合高通量检测等缺点。为克服传统方法这些方面的缺点，Cytoskeleton公司开发了新一代的G-LISA™检测方法，用于快速简便地检测GTP酶活化水平。
G-LISA实验原理及操作步骤
1.首先将效应蛋白的受体结合域（RBD）包被96孔板；
2.样本中GTP(活化状态)结合形式的蛋白分子则可结合到板上，而GDP(无活性状态)结合形式蛋白则不结合；
3.洗去未结合的蛋白；
4.然后依次加入特异性的一抗和HRP-二抗进行孵育结合；
5.后利用合适的酶底物OPD或化学发光试剂显色。
Swiss 3T3 细胞中，Activators活化的Rho蛋白（左）和Rac蛋白（右）
传统Pull down法和G-LISA法的比较
原理 | 用包被效应蛋白的亲和磁珠选择性的结合有活性的GTPase，用western blot检测信号 | 用包被效应蛋白的96孔板选择性的结合有活性的GTPase 用ELISA检测信号 |
实验设备 | SDS-PAGE、Western blot相关仪器 | ELISA相关仪器 |
上样量 | 300 - 2000 µg per assay | 5 - 50 µg per assay |
样品数量 | Up to 10 samples | Up to 96 samples (or more) |
结果定量 | WB具有很窄的线性范围。此外，样品的多次操作也会导致某种程度上的变异分析。 | 提供定量的数字读数 |
反应时间 | 10-12h | ＜3h |
G-LISA法对比传统的pull down，主要有操作简便、上样量少、可同时检测多个样本、反应时间短、定量结果准确、与小鼠、大鼠和人的组织和细胞兼容等优势。
小G蛋白活化检测试剂盒Pull-down实验结果展示：
Lanes 4 & 5:10 ng/ ml of EGF， 2min
Lanes 2 & 3: Persistent serum starvation
Lanes 1: 20 ng of recombinant Rac1-His protein run as a western blot standard
小G蛋白活化检测试剂盒G-LISA实验结果展示：
分别用CN01（蓝色Activators）和LPA（红色）处理后RhoA的活化进程
