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elisa试剂盒检测免疫共沉淀实验特性

阅读:232发布时间:2016-12-19

elisa检测试剂盒免疫共沉淀原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择zui后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。
二、准备工作:
预冷PBS,RIPA Buffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机
1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次,zui后一次吸干PBS;
2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)
3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)
4. 4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中
5. 准备Protein A agarose,用PBS 洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠
6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景
7. 4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除Protein A珠子
8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)
9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10 μg/μl)
10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异
11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育
12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2 μl"过渡抗体"(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)
13. 14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS
14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60 μl足够上三道)
15. 将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。
elisa检测试剂盒
2-氯-5-甲基吡嗪    CAS号:    59303-10-5    进口、组装
2-甲基-6-三氟甲基苯胺    CAS号:    88301-98-8    进口、组装
3-溴哒嗪    CAS号:    88491-61-6    进口、组装
N-BOC-3-环己酮胺    CAS号:    885280-38-6    进口、组装
6-溴-1H-吲唑-4-甲酸    CAS号:    885523-08-0    进口、组装
2-氯嘧啶-5-羧酸乙酯    CAS号:    89793-12-4    进口、组装
7-碘吲哚    CAS号:    89976-15-8    进口、组装
3,5-二氟苄胺    CAS号:    90390-27-5    进口、组装
2-氯吩噻嗪    CAS号:    92-39-7    进口、组装
对羟基联苯    CAS号:    92-69-3    进口、组装
反式-2-己烯-1-醇    CAS号:    928-95-0    进口、组装
吲哚-3-甲酸甲酯    CAS号:    942-24-5    进口、组装
(5-氟吡啶-2-基)硼酸    CAS号:    946002-10-4    进口、组装
3-氨基呋喃-2-甲酸甲酯    CAS号:    956034-04-1    进口、组装
1,2,4-*基苯    CAS号:    95-63-6    进口、组装
2-甲硫基-4-溴嘧啶    CAS号:    959236-97-6    进口、组装
elisa检测试剂盒

 


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