一、试验原理
在动脉粥样硬化和血管重建术后再梗死的主要病理基础上，血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的移行和过度增殖起着极其重要的作用。当血管内皮细胞受损时，单核细胞和血小板可黏附并分泌细胞生氏因子，可刺激VSMC移行与增殖。抑制VSMC移行和增殖的物质可抑制动脉粥样硬化病变形成和血管成形术后再梗死。取动物或人血管的中膜进行分离，在合适的环境下能使VSMC生长和进行传代，常用家兔、大鼠、牛、猪、羊及流产胎儿的主动脉、肺动脉及脑动脉。培养方法根据实验要求选取，在相同条件下观察细胞生长密度、DNA合成，可观察药物对VSMC生长的影响。
二、材料
1．待检药物。
2．动物：兔或大鼠等。
3．试剂：O．25％*、O．02%EDTA、10％CS、Hanks液、培养液、结晶紫、3 H—TdR药盒。
4．器材：净化工作台、CO2孵箱、倒置显微镜、液闪仪、分光光度计、多孔扫描分光光度计。
三、实验方法
(一)血管平滑肌组织块培养
1．将实验动物在无菌条件下取出所需血管，以Hanks液洗去血污，在盛有：Hanks液的培养皿中剥离外膜，纵行剪开血管，剥去内膜，剪去两端钳夹过的组织，以锋利的*剪成约1mm3小块，放试管中用Hanks液冲洗，自然沉降，去上清液。
2．用弯头种植针轻刺小块组织，以O．5 mm间距排列在培养瓶底上，轻轻翻转瓶底向上在37℃的C02孵箱中静置2～4h(为使组织块微干涸，以利于贴附)。
3．打开瓶盖，斜持瓶向其底角部加少量培养液(仍底向上)，再轻轻翻转培养瓶，使组织块浸泡在培养液中，放回培养瓶继续培养。
4．每3d换液1次，一般4～7d后细胞从组织块周围长出，2～3周后出现致密的细胞层，此时取出组织块，使细胞生长至融合。
(二)传代细胞培养
1．当原代细胞生长融合成单层细胞时，倾去培养液．以Hanks液洗涤培养瓶2次，然后以O．25％*O．02％EDTA混合液覆盖细胞表面，室温下作用约2 min。elisa试剂盒
2．在倒置显微镜下见到大部分细胞收缩、边缘清楚时，即翻转培养瓶停止消化。倾去消化液，加入含l0%CS的培养液，用吸管轻轻反复吹打瓶壁，把细胞吹打成悬浮状并进行细胞计数。
3．以5×104～5×105个／ml浓度接种在新培养瓶中，在37℃的CO2孵箱中培养，每3天换液1次，至细胞生长至致密单层时进行第二次传代。
(三)待检药物处理
一般传至5～6代，得到数量较大而又均一的细胞时进行实验。给药组加入不同浓度药物，预孵一定时间，与对照组比较，观察药物对生长因子的作用。实验常在96孔或24孔培养板上进行。
四、结果分析与鉴定
(一)细胞观察
1．在倒置相差显微镜下，当细胞长满瓶底时，典型的平滑肌细胞为梭形，平行呈束状排列，密集与稀疏交叉呈“峰”与“谷”状，峰处细胞密集、多层；谷处细胞稀疏甚至没有细胞。
2．电镜下观察，可把平滑肌细胞分为“合成型”与“收缩型”两型。前者胞质充满楹面内质网，但粗肌丝或细肌丝很少，肌动蛋白的抗体荧光染色为阴性，细胞无收缩功能。“收缩型”细胞是平滑肌细胞的典型表现，主要特征为胞质内有束状肌丝，细胞有收缩功能。
3．原代培养的zui初1周内细胞以“收缩型”为主，以后逐渐向“合成型”转化且大量繁殖。传代培养zui初从“收缩型”向“合成型”转化很快，6～10d后又复原，但已无收譬功能。
(二)MTT比色法
1．MTT能进入活的线粒体内，与各种脱氢酶反应，可用于测定细胞的成活及增殖。elisa试剂盒
2．以PBS溶解MTT制成5mg／ml溶液，抽滤灭菌。按每孔100μl培养液加入10μl的量把MTT加入细胞培养孔内，在37℃继续培养4 h。
3．取出培养板，吸出孔中培养液，每孔加入100μl酸性异丙醇(含0．04 ml／L HCl)，使深蓝色结晶*溶解。
4．在室温下放置数分钟，确认结晶*溶解后即把培养板在570 nm、630 nm处．控l设在1．99(如样品着色过强，则设在1．00)的多7L扫描分光光度计下读数。在加入异丙后l h内测定完毕。
5．也可以使用DMSO每孔320μl代替异丙醇溶解细胞内MTT，在酶联免疫测定仪上司570nm或570 nm、630 nm双波长处测定吸光值并分析。
(三)3 H-TdR放射免疫测定
1．将待测细胞吸去培养液，每孔加入含3 H—TdR的培养液200μl(含放射量3．7×10 4Bq)，37℃孵育24 h后终止培养。
2．以冷PBS200μl清洗3次，加入4℃的10％TCA 200 μl，放于4℃冰箱内30 min。
3．吸去TCA，加入一乙醇(1：2)混合液200μl漂洗，吸去液体，晾干。
4．加入O．4 mol／L NaOH溶液每孔200μl溶解细胞，在56℃恒温箱中放置2h。
5．吸出全部液体，注入含有5ml闪烁液的闪烁瓶中，加盖摇匀，放置2h后进行液闪测定。
五、注意事项
1.平滑肌细胞取材广泛，但以年幼动物血管的平滑肌细胞较易培养成活。
2．CS的质量与实验关系密切。有条件时可加入PDGF等细胞生长因子。
3．在加入药物前，先以含O．4％CS的培养液培养细胞48～72h，然后改换含10％CS的培养液，可提高细胞对药物的敏感性。
