ELISA试剂盒操作流程如下：
（1）待测样品孔中每孔加入待测样品100μl，每种样品设3个平行孔；设两个阴性对照孔，每孔加未处理组的细胞裂解液100μl；另设一个空白对照孔，加入纯细胞裂解液100μl。
（2）酶标板置4℃，包被过夜。
（3）洗板：吸干孔内反应液，用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注满板孔后，即甩去），之后将洗涤液注满板孔，浸泡1-2分钟，间歇摇动。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗涤3-4次。
（4）阴性对照孔每孔加入PBS 50μl，样品孔及空白孔每孔加入1:500稀释的兔抗人AIF抗体工作液50μl。
（5）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。
（6）洗板，同（4）。
（7）每孔加1:5000稀释的HRP-标记的山羊抗兔抗体工作液 100μl。
（8）酶标板置37℃培养箱的湿盒内，孵育60min。
（9）洗板，同（4）。
（10）每孔加TMB显色液 100μl，轻轻混匀10s，置37℃暗处反应15-20min。
（11）每孔加100μl 2mol/L H2SO4终止反应。
（12）分别测450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2，zui终测得的OD值为两者之差（W1-W2），以减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。
（13）数据处理：在得出标本（S）和阴性对照（N）的 OD值后，计算S/N值。S/N≥2.1为阳性判定标准。
注：所用溶液配方
（1） PBS：称取0.2g KH2P04, 2.9g Na2HP04?12H20、8.0g NaCl, 0.2g KCl，加双蒸水至1000ml。
（2）包被缓冲液：称取1.59g Na2CO3, 2.938 NaHCO3，加双蒸水至 1000m1。
（3）洗涤液（PBST）：含0.05% Tween-20的PBS。
（4）稀释液：含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS，主要用以稀释抗体、标准品、样品。
（5）TMB显色液：称取1.84g Na2HP04.12H20, 0.51 g柠檬酸，加双蒸水至1O0ml，配成柠檬酸-磷酸缓冲溶液。用10.5 ml 柠檬酸-磷酸缓冲溶液溶解1锭TMB，再加入35μl 3% H2O2
（6）细胞裂解液：1% TritonX-100，137mmol/L NaCl，20mmol/L Tris-HCl，2mmol/L EDTA，1mmol/L PMSF，pH 7.4。（其中PMSF溶于异丙醇中，配成1O mmo/L，-20℃ 贮存备用。
ELISA试剂盒
