基于分子生物学和重组技术的发展，蛋白质和多肽已经成为一类重要的药物，但是其稳定性差，生物利用率低，半衰期短等问题也日益受到关注。本文重点介绍了一些新的给药途径和给药系统，例如鼻腔、颊等给药途径以及黏膜给药系统、透皮给药系统、缓控释技术等给药系统的进展。综述了对于蛋白质和多肽药物进行定点突变和化学修饰，以达到增加其*性的一些新方法。
关键词：蛋白质；多肽药物；*性；给药系统；定点突变；化学修饰elisa试剂盒

由于20 世纪60 
年代初固相多肽的合成以及70年代初期重组脱氧核糖核酸技术的产生，以及近年来分子生物学和基因重组技术的提高，蛋白质和多肽越来越广泛的被应用于临床，以攻克难以*的疾病。在zui近的一份调查报告中，324 
种生物技术药物(包括临床试验或者正在接受管理部门审查的药物)几乎覆盖了150 
种疾病，包括癌症、自身免疫性疾病以及艾滋病等传染病。这些物质中相当数量都是蛋白质[1]。蛋白质作为药物的研究虽然取得了快速发展，存在的问题也日益突出，如给药系统的不完善，稳定性差，在体内半衰期短，生物利用率低等。针对这些问题，科学家基本遵循两种解决途径，*是寻找一条蛋白质药物高生物利用率的给药途径；第二是通过化学修饰来优化蛋白质的代谢动力学特性，以延长其半衰期，达到*稳定的目的。

1　影响蛋白质和多肽药物*性的因素影响蛋白质和多肽药物*性的主要因素[2] 
：(1)当药物进入系统时，由各种酶引起的代谢，尤其是多种形式的蛋白水解酶的作用，可导致药物降解为小分子肽或者氨基酸。这类酶广泛存在于胃、肠道、肝脏和肾脏等器官中[3]，其分布具有细胞组织的特异性。 
(2)非蛋白酶因素的影响来源于蛋白质物理或化学上的变化。物理变化包括聚合、沉淀；化学变化包括氨基酸残基的修饰，主要有氧化作用、还原作用、脱酰胺反应、水解反应、β 
消除、二硫化物交换等几种反应，并且蛋白质在构建中的稳定性和免疫原性以及导致蛋白质化学结构错误变化的环境条件也被认为是影响蛋白质代谢稳定性的主要因素。 (3) 
较大的多肽常通过受体介导的方式来清除，有不少例子显示，受体介导的清除可能是一种主要的清除机制。例如胰岛素，若减少与受体的亲和力就会显著提高其血浆半衰期。受体介导清除的限速步骤是药物与细胞表面受体形成非共价物的过程。受体清除具有细胞特异性。 
(4)不同的给药途径对于药物的体内分布、代谢过程、生物利用度和药理作用也具有显著的影响。成功改造的蛋白质依赖于对其理化和生物学特性的充分了解，包括化学和物理稳定性、免疫原性和代谢动力学特性。蛋白质的治疗活性高度依赖于它的构象结构。可是，蛋白质的构象是可变的并且对外在环境十分敏感，这就是说，、设计和处理蛋白质需要特别注重疗效和安全性的*化，包括尽可能减少免疫反应[4]。elisa试剂盒

2　给药系统(drug-delivery 
system，DDS)研究进展口服是和zui广泛适用的给药途径，但是这种途径一般不适用于蛋白质这样的生物大分子的给药。蛋白质在胃肠道的内在不稳定性，以及由于较高的相对分子质量和极性表面特性而对生物膜的低渗透性，表明蛋白质在用于全身治疗时只能避开胃肠道给药。科学家还在进行不断的尝试，通过选择不同的给药途径达到较高的生物药效率，如鼻腔或肺部途径。尽管如此，非胃肠道给药的生物药效率很低并且通常不足以达到有效的全身效应。近年来，给药系统的研究有了十分乐观的进展，下面介绍几条目前蛋白质给药的热点途径。
2.1　黏膜给药系统(mucosal 
drug delivery 
system)
黏膜给药系统是使用合适的载体在人体黏膜部位给药，如鼻黏膜、口腔黏膜、眼黏膜、直肠黏膜、子宫及阴道黏膜，药物透过黏膜进入体循环产生全身或者局部治疗作用的治疗方式。黏膜给药剂型需要具有生物黏附性的辅料，可用作释药系统的黏附材料包括天然聚合物，有明胶、脱乙酰壳多糖、凝集素、海藻酸钠等，还有合成聚合物卡波姆(CP)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)和聚乙二醇(PEG)等。这些聚合物能很好地黏附于水性生物膜上，从而使药物在病灶部位既能迅速发挥药效，又能长时间维持药效。黏膜给药大大拓宽了许多药物的给药途径，特别是一些多肽类、大分子类药物。
2.1.1　鼻黏膜给药　鼻黏膜是黏膜免疫系统的重要部分，鼻腔内含有丰富的血管，经鼻腔接种既可产生黏膜免疫又能产生系统免疫，鼻黏膜给药因为其吸收面积大，不经过肠循环，生物利用度高等优点，成为蛋白质及多肽药物的理想给药途径之一，如胰岛素，在胃肠道中几乎不能吸收，但却可通过鼻黏膜、眼黏膜吸收。多年来，对于鼻黏膜给药剂型的研究较多，如固体粉末制剂、生物黏附性微球、脂质体等，这些新剂型突破*气雾剂等传统剂型易被鼻黏膜纤毛清除的缺陷，使药物在黏膜停留时间长，从而达到*的目的。在对剂型改造的同时， 
Kimbell等 
[5]对传统给药方式也有了新的诠释。他们研究鼻腔喷雾剂行为，用实验测量和计算其流体动力学并建立模型，通过了解鼻气流中离子输送途径，设计更有效的喷雾，达到药物*目的。
2.1.2　颊黏膜给药以及口服给药　口腔黏膜给药具有以下特点：(1)口腔黏膜中的颊黏膜和舌下黏膜部位的血管密集，血流丰富，黏膜组织的通透性仅次于鼻黏膜；(2)与鼻腔给药和经皮给药相比，口腔黏膜中酶的活性更低，因此可以有效地避免药物的降解和代谢；(3)口腔黏膜具有较强对外界刺激的耐受性，当黏膜组织受到制剂中的一些成分产生刺激性和损伤，停止用药后能够较好的恢复；(4)剂型易定位，用药方便，可以随时撤去药物，易被患者接受[ 
6 
]。口服疫苗是蛋白质疫苗中比较新的方法，两种口服疫苗——萨宾口服脊髓灰质炎疫苗和Ty21伤寒疫苗在美国等地被列入疫苗接种计划。目前，包括艾滋病、炭疽、子宫颈癌、霍乱、胃肠炎、腹泻和疟疾等疾病的疫苗都在尝试口服*[7]。据报道，可溶性蛋白质抗原当口服给药时可以刺激产生免疫[ 
8]。口服蛋白质药物主要采用两条给药路线，一是利用生物黏附(bioadhesion)原理[9]，用聚合物材料起定位“平台”作用，通过黏膜给药，使制剂具有局部靶向性、*性的双重特点。Bernkop-Schnurch和Pasta[10]研究表明，通过壳聚糖及其衍生物与酶抑制剂的结合物降低消化酶对蛋白质和多肽类药物的代谢，可以大大提高胰岛素口服生物利用度。二是采用保护的形式，将抗原包被起来，保护性材料可以保护药物不受胃肠道消化酶的破坏，增加药物与胃肠道黏膜的紧密接触，提高生物利用度。2.1.3　肺部吸入给药　目前对于蛋白质药物肺部吸入给药的研究越来越多，很多蛋白质药物，如亮丙瑞林、胰岛素、生长激素可以生理活性型从肺部吸收，生物利用度超过胰岛素与生长激素不加促进剂鼻腔给药系统的生物利用度。Norwood 
等[11] 
指出，与皮下胰岛素注射相比，吸入性人胰岛素(Exubera)可提供血糖控制，并且对肺功能只有轻度、可逆的作用，可替代胰岛素注射给药。肺部给药已取得重大进展，现已进入临床试验阶段。黏膜给药系统延长药物在吸收部位的滞留时间，使药物与黏膜上皮紧密接触，改善黏膜上皮吸收差的药物(如蛋白质多肽类药物)的吸收情况，提高生物利用度，还有一些生物黏附性聚合物具有抑制蛋白水解酶的作用，为蛋白质药物给药开辟新的途径，近年来已引起人们的广泛关注和重视。
2.2　透皮给药系统(transdermal 
therapeutic system，TTS；transdermal delivery 
system，TDS)
透皮给药系统是指在皮肤表面*伤给药，药物以恒定的速度通过皮肤进入体循环，产生全身或者局部治疗作用。透皮给药系统很有前景，相关制剂已经发展成为数十亿美元的工业。患者选择透皮制剂因为它的方便：不需要按时服用，也没有任何痛苦，并且可随时中断用药；因为它们的功效，这些制剂同样受到医生们的欢迎：它可以避免口服药产生的并发症、低吸收率、胃肠道酶对药物的降解作用以及注射方式带来的血药浓度的峰谷现象，尤其解决了蛋白质和多肽药物在体内易被降解和半衰期短的问题。透皮给药zui大障碍是皮肤角质层的阻碍，Chen等[12]，用一种基于噬菌体展示的新的高通量的筛选方式，从数以百万计的多肽中找到一种伴侣，它可运送蛋白质通过皮肤，并发现一个*的序列，并在动物模型中得到证明；它能够显著增加胰岛素和人生长激素的透皮运输，不同于以往物理和化学的方法。Chen 
等[12]采取生物的方法增加皮肤的通透性，并应用于胰岛素和它们的多肽的复合物，增加了大鼠血浆的胰岛素水平，降低了血糖水平。透皮运送的人生长激素同样增强，这说明该方法可广泛适用。这种分子伴侣使得蛋白质药物透皮给药系统的有了激动人心的发展。
2.3　缓控释技术(controlled 
release drug delivery 
system)在蛋白质药物注射给药系统中，常采用以镶嵌(entrapment)和包囊(encapsulation)为主要方法的缓控释技术，包括聚合体给药系统( 
水凝胶、纳米胶囊、微球体等)和脂类基础的给药系统(脂质体、固体脂质纳米粒等) 
。缓控释给药可减少给药次数，注射后患者血药浓度稳定，在体内作用时间长，从而增加药物*性。水凝胶是交联的亲水聚合物，通过形成三维网络，对pH、离子强度、温度等生理性刺激的应答有一定比例的降低[13]，这些都有助于蛋白质释放的控制。水凝胶物质可以作为微球给药，或者在原位组成给药系统。原位组合系统与传统的微球有许多优势，给药方便，复杂性和潜在危险低，在制药条件方面更适合蛋白质这样的敏感药物分子[14]。Bako等[15]将纳米复合材料的生物相容性水凝胶(NCHG)，作为局部给药装置，用于牙周感染的原位给药。在水溶液中，纳米粒子被自由原子捕获，引起单体、2 
- 羟乙酯(HEMA)和聚乙二醇二甲基(PEGDMA)的共聚作用，由光聚合交联在一起。之后药物被包入纳米粒子，通过溶胀行为释药。研究发现，一般药物释放是在24h 
内，但是NCHG 对药物释放期超过48h，达到*目的。

3　定点突变和化学修饰治疗用蛋白质的*性可以通过多种方式的化学修饰来实现。例如，通过突变一个或者多个氨基酸(就是创造一个蛋白质类似物)或者通过糖基化、酰基化或PEG化修饰。这些修饰可以优化蛋白质的代谢动力学特征，但同时，蛋白质的生物学特性也会改变，所以要十分小心。
3.1　定点突变(site-specific 
mutagenesis)
人α 干扰素( hIFN-α)提供了一个很好的例子。hIFN-α 
是与阻止病毒感染密切相关的蛋白质家族，它可以抑制细胞增殖和调节细胞分化。重组hIFN-α2已被证明可有效治疗各种人类病毒性疾病和癌症。然而，由于其体循环半衰期短，在一段较长时期内必需频繁给药。Ceaglio 
等[16]利用糖基化策略进行定点突变。将一段N-糖基化共有序列插入到干扰素的不同位置，构成4N 和5N- 
干扰素变异体，其大小和带电量等因素增加，减轻了肾脏对干扰素蛋白质的清除。药代动力学实验同时显示了4N 和5N- 干扰素变异体，与非糖化hIFN-α2 
相比，其半衰期增长了25 倍，全身清除率下降到原来的1/20。此外，静脉注射接种后，4N 类似物无论是在分布还是半衰期，都是非糖化干扰素的11 
倍。由此可见定点突变技术可显着改善蛋白质药物的药代动力学性能，延长半衰期。重组人类白介素-2(IL-2)是另一个例子，它的疗效是通过基因重组设计实现的。市售非糖IL-2 
类似物阿地流津(aldesleukin)是一种人IL-2 脱酰类似物，其中125 位上的半*被*取代。实验用IL-2 类似物BAY 
50-4798(Bayer)是另一种遗传工程蛋白质，它潜在地提高了IL-2 
的*性。
3.2　糖基化修饰(Glycosylation)蛋白质的糖基化是真核生物的一种常见的翻译后修饰方式。随着基因工程技术的发展，已有越来越多的药用重组蛋白被制备，它们多属于糖蛋白，如重组人促红细胞生成素(rhEPO)、重组人组织纤溶酶原激活剂(rhtPA)等。蛋白质表面的糖链能够影响蛋白的药物动力学作用、生物活性、稳定性、对蛋白酶的易感性、水溶性、凝集性、免疫原性等。对于治疗性蛋白质，糖基化形式与非糖基化形式相比，可增加血清半衰期，并且糖基化蛋白质对蛋白酶水解作用较不敏感，也具有较强的热稳定性。用基因工程手段对TNK组织纤维蛋白溶酶原激活剂分子进行糖基化修饰，实验结果表明，修饰后的蛋白质具有更长的半衰期，并且在急性心梗治疗中可以采用低剂量单次快速注射[17]。促红细胞生成素(EPO)是一种调节红系祖细胞生长的细胞因子[18]。EPO 
是一个高度糖基化的含唾液酸的酸性糖蛋白，由165 个氨基酸组成，其成分约有60%蛋白质和40%糖(重量百分比)。EPO 含3 个N- 糖链和1 个O- 
糖链。研究表明，EPO 的糖基化不影响其体外生物学活性，但却可延长体内半衰期。由此，Amgen 公司的科学家合成了一种新型的促红细胞生成蛋白(novel 
erythropoiesis stimulating protein，NESP)。与EPO 相比，NESP 在33 和88位各增加了1 个N- 
糖基化位点。NESP 的体内半衰期是EPO的3 
倍，从而达到了减少用药次数的目的。
3.3　聚乙二醇化修饰(PEGylation)
通常，PEG修饰通过减少代谢和体循环中受体介导的对蛋白质的吸收，达到降低血浆清除率。PEG修饰同时通过保护性抗原和免疫原也增加了安全性[19]。我们必须了解，PEG 
多聚体由许多不同的分子聚合而成，另外，大分子蛋白质中还有很多可以结合PEG的位点。所以无论从效率还是从安全的观点，由于这种潜在的产物的异质性，PEG 
修饰需要进行优化，其中，PEG 定点修饰是近年来比较热门的方法。2006 年，申请美国的PEG 化粒细胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)[20]和PEG 
化白细胞介素-10 (PEG-IL-10)[21]便是N端氨基定点修饰产物。急性腹腔注射胆囊收缩素( CCK ) 可诱发显著的厌食症， 
但这种药物持续时间短。因此，Verbaeys 等[22]利用胆囊收缩素与相对分子质量为10 000 
的聚乙二醇共价配对，形成共轭产物PEGCCK9，然后对其药物代谢方面做了详细的记录，实验结果表明PEG-CCK9 比未经修饰的CCK9 
有着显著*的厌食症症状。Na 等[23]选用mPEG-SPA 和mPEG- 丁醛(mPEGsuccinimidyl 
butyraldehyde)修饰奥曲肽(Octreotide)，其中mPEG- 奥曲肽在体内的半衰期提高了2 
倍，而且mPEG-丁醛修饰产物在制备微球过程中有很好的防PLGA(乳酸/ 
羟乙酸共聚物)酰化作用。
3.4　酰基化修饰(Acylation)
在一些例子中，脂肪酸这样的化学连接物通过在蛋白质表面暴露残基可增加蛋白质与血清白蛋白的亲和力，从而增加它在血液中的循环时间。酰基化对于小蛋白和多肽更有效，因为它相对更大的增加了蛋白质的疏水性。例如，酰基化人胰岛素类似物(B30 
酰基化)相较于地特胰岛素(insulin 
detemir)更加*，并且在一些国家已经通过监管部门的认可。酰基化的原理也同样成功地运用到了其他蛋白的构建上，如胰高血糖素样肽1(GLP1)和干扰素α，以及*(*)。然而，酰基化胰岛素和GLP1 
是位点特异的，而干扰素的酰基化就不那么特异。

4　蛋白质和多肽药物的前景
由于人们对药物安全及毒副作用的关注，基因工程药物的研究也越来越受到重视。经过20多年的努力，我国的基因工程药物取得了突飞猛进的进展。近年来，随着多肽和蛋白质结构与功能的不断明确，很多蛋白质和多肽药物被研制出来并且进入临床阶段，但是蛋白质和多肽药物半衰期短，需频繁给药，在生理和心理上对患者造成*负担；而蛋白质和多肽药物的*性的研究不但解决以上问题，而且使一些由于半衰期短而无法进入应用的药物获得很好的治疗效果，所以，蛋白质及多肽药物的研制有着广泛的前景。