elisa试剂盒 制备大量具有活性的原生质体是微生物原生质体融合育种的前提。活性原生质体制备过程包括原生质体的分离、收集、纯化、活性鉴定和保存等操作步骤。
为了制备原生质体，必须有效地除去细胞壁。细胞去壁后，原生质体从中分离出来，此过程称为原生质体分离。去壁的方法有三种：机械法、非酶分离法和酶法。以酶法zui为常用。酶法分离原生质体的本质是以微生物细胞壁为底物的酶水解反应。
(1)酶法制备原生质体的条件
①培养基组成酶法分离原生质体，首先要培养菌体。培养菌体时不同的培养基会明显影响原生质体的形成。一般放线菌只有在加*的培养基中培养后，才能使酶类易于渗入和瓦解细胞壁，释放原生质体。加入*的浓度通常控制在明显抑制菌体生长但能获得适量的菌丝体为宜。
②菌体培养方式菌体培养可采用平板玻璃纸法，或振荡沉没培养法，也可以把振荡培养的菌丝体采用匀浆器或超声波破碎法，使菌丝断裂或细胞壁松弛。
③菌体菌龄微生物生理状态是决定原生质体形成的主要因素之一，尤其是菌龄，明显影响原生质体形成的频率。丝状真菌以年轻的菌丝来分离原生质体，尤其是菌丝生长点，其复制周期与原生质体形成有密切关系。具体的菌龄随菌种和培养条件而异，细菌和霉菌一般采用对数期，而放线菌以对数期到静止期的转换期较理想。
④稳定剂原生质体由于剥除了细胞壁，失去了细胞壁*的保护作用，因此对外界环境变得十分敏感，尤其是渗透压。如果把原生质体悬浮在蒸馏水或低渗溶液中，则原生质体会膨胀破裂，所以必须在一定浓度的高渗溶液中进行酶解、破壁，才能形成和保持稳定的原生质体。这种高渗溶液被称为稳定剂。稳定剂的种类有无机盐和有机物，无机盐包括NaCl、KCl、MgSO4、CaCl 2等。有机物包括蔗糖、甘露糖、*等。
⑤酶解前的预处理用酶水解细胞壁，首先要使酶渗透到细胞壁中去。但生物体都有保护自身的一套严密的结构，不是任何物质都可以随意进入细胞壁。因此。在酶解前要根据细胞壁的不同结构和组成加人某些物质进行预处理，以抑制或阻止某一细胞壁成分的合成，从而使酶易于渗入细胞壁，提高酶对细胞壁的水解效果。如SH一化合物广泛应用于酵母菌和丝状真菌的预处理，效果较好，其作用主要是还原细胞壁中蛋白质的二硫键，使分子链切开，酶分子容易渗入，促进细胞壁水解，释放原生质体。在腐霉中加入Triton X一100或脂肪酶后，可以除去细胞壁上的脂肪层，促进酶分子进入细胞壁，有利于原生质体的释放。酵母菌常用EDTA或EDTA加巯基乙醇进行预处理。在放线菌培养液中加入*有利于原生质体的释放，其作用是在细胞壁合成过程中*错误替代*而干扰细胞壁网状结构的合成，使酶进入细胞壁，有助于瓦解细胞壁。细菌通常加入亚抑制量的*，以抑制细胞壁粘肽组分的合成，有利于酶对细胞壁的水解作用。
⑥酶系和酶浓度各种微生物由于细胞壁的组成不同，用于水解细胞壁的酶的种类也不相同。细菌和放线菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，可以用*来水解细胞壁。真菌细胞壁组成较复杂，常用蜗牛酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶等来水解细胞壁。
不同的微生物对酶的浓度要求也有差异。一般来说，酶浓度增加，原生质体的形成率也增大，但超过一定范围后，酶浓度增加对原生质体形成率的提高不明显。酶浓度过低．不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率降低。因此，建议以使原生质体形成率和再生率之积达到zui大时的酶浓度作为酶浓度。elisa试剂盒
⑦酶的作用温度和pH值酶的作用温度和pH要根据酶的特性和菌种特性决定。
⑧酶解时间原生质体的形成与酶解时间密切相关，酶解时问过短，原生质体形成不*，会影响原生质体间的融合；酶解时间过长，原生质体的质膜也易受到损伤，从而影响原生质体的再生，也不利于原生质体的融合。
⑨菌体密度为了提高原生质体的得率，还要注意酶液中菌体密度。对丝状菌一般3mL酶液中加人300mg新鲜菌丝体较合适，过多过少都难以得到zui大量的原生质体。
⑩酶解方式酶解方式也会影响原生质体的形成。酶解过程要经常轻微摇动混合液，这不仅能使菌丝体不断地接触新鲜酶液，而且能补充氧气，有利于原生质体的释放。
(2)原生质体形成率的测定鉴于原生质体在低渗的蒸馏水中比未破壁的正常细胞容易破裂，而且在普通培养基中也难以再生细胞壁和形成菌落，因此可用多种方法测定原生质体形成率。
①适合于细菌和酵母菌的测定方法。
a.用*分别计算蒸馏水加入前(以A表示)和蒸馏水加人后(以B表示)的细胞总数，则原生质体形成率可用下式计算：elisa试剂盒
b．把加入蒸馏水前(A)和加入蒸馏水后(B)的菌体混合物，分别涂布于高渗再生培养基上，计数菌落数，则原生质体形成率可用下式计算：
②适合于霉菌和放线菌的测定方法 由于这些菌酶解后的原生质体成串成堆．而且未脱壁细胞又是丝状体，所以不宜直接用*计数。可用如下方法测定。
a.把已原生质体化的菌体混合液，分别等量悬浮于高渗溶液(A)和蒸馏水(B)中，然后涂布于高渗的再生培养基上，计数菌落数，则原生质体形成率可用下式计算：
b.把原生质体化的菌体混合液悬浮于高渗溶液中，分别涂布于高渗再生培养基(A)和普通琼脂培养基(B)上，计数菌落数，则原生质体形成率可用下式计算：
