在ELISA检测试剂盒中应用的抗体可分为多克隆抗体（多抗）和单克隆抗体（单抗）。多抗取白免疫动物的抗血清，制备较简单，但抗血清成分复杂，除含针对抗原（多个表位）的抗体外，还含有多种其他抗体，亲和力和特异性相对要低于单抗，且制备周期长，批间差异较大。而单抗仅针对抗体的单一表位，亲和力和特异性均较多抗高，且制备技术成熟，产量大，批间差异小，但结合位点的单一也正是其弱点之所在，在双抗体夹心法中，如包被和指示抗体使用同一单抗，则由于结合位点的缺乏，容易造成假阴．性结果。
在使用双单抗一步法时，ELISA检测试剂盒应注意抗原过剩时的“钩状效应"上式中DH2为供氢体（即底物），H2O2为受氢体。HRP对受氢体的专一性很高，除H2O2外，仅作用于小分子醇和尿素的过氧化物。HRP的底物有多种，在ELISA中常用的有：邻苯二胺（orthophenylenediamine，OPD），四甲基联*（3，3，5，5- tetramethyl-benzidine，TMB）和2，2，-连氮基-双-3-乙基苯噻唑啉磺酸盐[2，2，-azino-bisc（3- ethyl-benzthiazolinesulfonate-6），ABTS]。三者各有优缺点：OPD是在ELISA中应用zui多的底物，灵敏度高，比色方便，但配成溶液后稳定性差，且有致异变性；TMB经酶作用后由五色变蓝色，加酸终止反应后显黄色，目测对比鲜明，可比色定量，溶液的稳定性也较差，但无致异变性，因此应用日见增多；ABTS虽然灵敏度不如OPD和TMB，但空白值很低。
在ELISA检测试剂盒中酶作用于底物后生成有色物质、荧光物质或导致化学发光，分别可用分光光度计、荧光光度计测量及照度计测量。荧光和化学发光测定的敏感度均高于比色测定，标准曲线的线性范围亦较比色反应宽，测定效果优于常用的比色ELISA检测试剂盒。
（2）ALP：是一种磷酸酯的水解酶，用做示踪酶的ALP活性应在l 000U／mg以上。ALP常用的底物为对硝基苯磷酸盐（PNP），降解产物为黄色的对硝基酚。经NaOH终止酶反应后，ELISA检测试剂盒颜色维持比较稳定。
