缓冲液配方的常见问题
阅读：549发布时间：2016-11-3
缓冲液配方的常见问题
UU.转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？
解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris－HCl就是Tris盐用HCl调ph值，配置而成。
VV.准备做大鼠脑的WesternBlot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？
解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。
WW.想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？
解答：一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。
XX.zui近作了两次WesternBlot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？3、*次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为0.1%，不会是封闭液的问题吧？
解答：可以在下面几个问题上找找原因。1.封闭液用5％Milk，漂洗液（washingbuffer用TBST）2.看看一抗是否能work，降到1：20。3.看看二抗是否有问题。
YY.加甲醇的目的是什么？
解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。
ZZ.“转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBSTzui后那个T是Tween吗，浓度多大？
解答：是Tween，配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20(TBST),Dissolve8.8gofNaCl，0.2gofKCl，and3gofTrisbasein800mlofdistilledH2O,Add500ulofTween-20,AdjustthepHto7.4withHCl,AdddistilledH2Oto1L,Sterilizebyautoclaving.
AAA.封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如现在我就在室温里做，或者要在4度下?
解答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。
BBB.实验室暂无NP40我用sds可以吗？另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？配方如下：7M尿素，2M硫脲，Triton-x-1000.2ml，新鲜加入：65mMDTT
蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTMProteaseinhibitorcocktailkit1%(v/v)
是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？
改良的RIPA裂解缓冲液(Tris.HCl，50mmol/L，pH7.5;NaCl，150mmol/L;NP-40，1%;脱氧胆酸钠，0.5%;SDS，0.1%;EDTA，1mmol/L;PMSF，1mmol/L;Leupeptin，2μg/ml)不知对于膜蛋白效果如何？此外该方中的EDTA，是否用做蛋白酶抑制剂？
解答：做２－Ｄ不推荐使用ＮＰ－４０（因为即使进口的ＮＰ－４０也不纯，，其中的杂质会影响质谱结果）。对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail，因为7M尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性，２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。ＥＤＴＡ用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加过多的蛋白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做ＷＢ无所谓，做ＭＡＩＬＤＩ时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质(在2-D裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：提供连续的PH梯度，从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一部分核酸)；也不推荐采用SDS，因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变，如果您实在要用，终浓度降到0.1%以下。
CCC.WesternStrippingBuffer的配方
解答：METHOD1
1、strippingbuffer:62.5mmol/lTrisPH6.7；100mmol/lbeta-mercaptoethanol；2%SDS
二次发光protocol:1.strippingbuffer洗膜：50度水浴30分钟，摇床上摇10-20分钟。
2、1*PBST洗：摇床上摇30分钟。
3、封闭，加一抗，二抗（同*次发光）
METHOD2
（50ml总量）：?-mercaptoethanol342μl；20%SDS5ml；Tris-ClpH6.73.125ml；加ddH2O至50ml。
方法：将用过的膜浸入strippingbuffer中，置50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。
该方法的优点：省事，省力，省钱，符合惯例。
METHOD3
1、beta-metaptoethanol35ul
2、10%SDS1ml
3、tris(0.5M，pH6.7)625ul
4、dH2O3.34ml
50-55℃，30min。
METHOD4
strippingbuffer应该是可以放置很久的。不过我习惯于现配——毕竟，加了β-mercaptoethanol以后太难闻了，配了就用；而且，有了现成的Tris-HCl缓冲液和SDS的母液，现配还是很方便的。每次用量5ml少了点，我每次用50ml。
METHOD5
0.5MNaCl，0.5MHAc；室温摇床15min。
METHOD6
将用过的膜泡在1*TBS中室温振摇过夜，中间可以换液2-3次，然后封闭，加一抗，二抗（同*次发光），实践证明方法*可行。
不管用那种方法，洗脱后都要用PBS或TBS再洗几次。
