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临床ELISA试剂盒测定中zui容易出现问题的步骤，所以有时候一份标本用相同的试剂盒这次测定为阳性，下次测定为阴性，往往就是上述加样及试剂的错误所致。加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。其次，目前的商品ELISA试剂盒中的洗板液均需在实验室使用时对所提供的浓缩液稀释配制，因此稀释时所用的蒸馏水或去离子水应保证质量。
zui为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。这样做的目的，主要是为了在后面的温育反应步骤中，能使反应微孔内的温度能较快地达到所要求的高度，以知足测定要求。再如治疗药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的zui适时间抽血检测。温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。使用微量加样器加样必需留意的枢纽点是：加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出和产气愤泡。对用于激素和治疗药物测定的血清标本的收集，要留意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。
测定操纵非常简朴，一般涉及到标本的收集保留、试剂预备、加样、温育、洗板、显色、比色、结果判定和结果讲演及解释等方面，其中任一步骤的不当都会影响测定结果，且尤以加样、温育和洗板等步骤为甚。溅出会对临近孔产生污染。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响。，抗原抗体的结合反应在固相长进行，要使液相中的抗原或抗体与固相上的特异抗体或抗原*结合，必需在一定的温度前提下反应一定的时间。
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