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斑马鱼睾酮（T）ELISA试剂盒操作方法

阅读：206发布时间：2014-01-08

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斑马鱼睾酮(T)ELISA试剂盒操作方法

本试剂盒仅供研究使用。

检测范围： 96T

0.4nmol/L - 12nmol/L

使用目的：

本试剂盒用于测定斑马鱼血清、血浆及相关液体样本中睾酮(T)含量。

实验原理

本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中斑马鱼睾酮(T)水平。用纯化的斑马鱼睾酮(T)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入睾酮(T)，再与HRP标记的睾酮(T)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过*洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的睾酮(T)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中斑马鱼睾酮(T)浓度。

试剂盒组成

1	30倍浓缩洗涤液	20ml×1瓶	7	终止液	6ml×1瓶
2	酶标试剂	6ml×1瓶	8	标准品（24nmol/L）	0.5ml×1瓶
3	酶标包被板	12孔×8条	9	标准品稀释液	1.5ml×1瓶
4	样品稀释液	6ml×1瓶	10	说明书	1份
5	显色剂A液	6ml×1瓶	11	封板膜	2张
6	显色剂B液	6ml×1/瓶	12	密封袋	1个

标本要求

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤

标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

12nmol/L	5号标准品	150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液
6nmol/L	4号标准品	150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液
3nmol/L	3号标准品	150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液
1.5nmol/L	2号标准品	150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液
0.75 nmol/L	1号标准品	150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液

加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
温育：操作同3。
洗涤：操作同5。
显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

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