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研晶科研试剂供应网-抗体试剂网
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阅读：483发布时间：2013-10-29
免疫组化试剂盒，有礼*石 蜡切片的优点在于可以容易的存放在室温，而冰冻切片比较麻烦，一定要存在-80度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止RNA降解，保存 一贯很重要。冰冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。缺点是切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。
冰冻切片由于抗原性保存比较好，所以容易出阳性结果，但是组织结构形态的保存没有石蜡切片佳，而且抗原容易弥散，不易观察抗原分布情况。石蜡切片由于处理的原因，抗原常被封闭甚至破坏，需要抗原修复步骤，而且不一定能修复成功。
如何选择：
要求做冰冻切片的不一定能做石蜡切片，因为作石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，一般可作冰冻切片。
选择的时候同时看看所购抗体的说明书，看其适用于何种切片。若两种都适合，个人认为若染色的目的是为了看组织中有没有该抗原，可选用冰冻切片，若想了解具体的分布情况，可选择石蜡切片。
备注：抗体本身不可能限定一定要用冰冻切片或者一定要用石蜡切片，但抗体对2种切片都能做。这个要根据老师的目的来选择。
抗原修复我核对过技术参数，一下附录的4种都可以应用，zui常见选择方法2，但不管哪种，达到的目的一样。不存在哪种好哪种差的疑问！
石蜡包埋组织切片3~4μm 厚度 免疫组化试剂盒，有礼*
1.烤片：将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1 hr；
2.脱蜡：切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次（即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每次10 min；
3.水化：切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95%乙醇2次（每次2min），85%乙醇2 min；75%乙醇2min，自来水冲洗，ddH2O洗2×2min；
4.抗原修复：根据抗体说明书推荐方法进行抗原修复，常采用高压、微波（温度达到98~100℃）或酶消化修复法，室温自然冷却，自来水冲洗，ddH2O洗2×2min，TBS洗涤（2×2min）（具体修复方法见附1）* 注：有些抗原勿需修复，直接进入第5步封闭。
5.封闭：滴加试剂B，37℃湿盒孵育30 min；
6.加一抗：滴加用试剂C（选择合理的工作比例），37℃湿盒孵育2 hr 或4℃过夜；
7.洗涤： TBS-T洗涤（3×5 min）；
8.封闭：滴加试剂B，37℃湿盒孵育10 min； 免疫组化试剂盒，有礼*
9.加二抗：滴加用抗体稀释液稀释的*化二抗（试剂D），37℃湿盒中孵育30 min；
10.洗涤： TBS-T洗涤（3×5 min）；
11.封闭：滴加试剂Tween 20，37℃湿盒孵育封闭20 min；
12.加HRP-SA： 滴加用试剂C稀释的试剂E（1：50~200，终浓度5~20 nM），37℃湿盒中孵育30 min；
13.洗涤： TBS-T洗涤（3×5 min），TBS洗涤（2×5 min）；
14.显色：应用DAB溶液（试剂F）显色；
15.复染：自来水充分冲洗，复染，脱水，透明；
16.封片：待组织标本干后，用试剂缓冲甘油封固剂封片；
17.观察成像：显微镜下观察成像。
注意事项：
1. 修复后缓冲液须自然冷却，自来水冲洗后方能把切片取出，骤冷有可能导致结晶或抗原封闭。
2. 缓冲液的量必须保证所有切片都能浸泡到，用过的柠檬酸缓冲液不能反复使用。
3. 若试剂为微量浓缩液，用前应低速离心，将内盖和管壁附着的溶液离到底部。
4. 封片前一定要换用TBS充分洗涤，以便洗去组织上残留的Tween 20，否则会影响结果观察。
5. 如须复染细胞核，则在封片前复染或直接采用含有染核试剂的封片剂进行封片。
附1：
抗原修复方法
常用抗原修复液：柠檬酸缓冲液（0.01M pH6.0）、EDTA抗原修复液（pH8.0或9.0）等等。
一、酶消化修复法
切片脱蜡水化处理，TBS冲洗，在组织上滴加*或*，37℃孵育20~30min后TBS冲洗即可。
二、微波抗原修复法
微波盒中加入抗原修复液微波加热至沸腾，将脱蜡水化后的切片置于耐高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中档或继续微波10~15min，取出微波盒冷却至室温后，自来水冲洗，取出切片。因不同微波炉微波处理时间存在差异，须自行调整。
三、直接高压抗原修复法
取修复液于不锈钢高压锅中加热至沸腾，将组织切片置于耐高温切片架上，修复液沸腾后放入切片架，盖上锅盖，待喷气后计时1.5~2.5min即可脱离热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。
四、隔水式高压抗原修复法
不锈钢高压锅中加自来水加热至沸腾，微波盒中加入修复液于微波炉中加热至沸腾，将切片放入微波盒中，再将微波盒放入高压锅中盖上锅盖，待喷气后计时4~8 min即可关闭热源，自然冷却至室温后自来水冲洗，取出切片。此方法适用于较难检测或核抗原的修复。
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