远慕生物：核酸凝胶电泳观察法实验介绍

　　实验原理：琼脂糖是海藻中提取的线状高聚物，不同浓度的琼脂糖密度不同，一般PCR产物使用2%浓度，0.5Kb-10Kb的DNA使用1%浓度，基因组DNA使用0.3%-0.7%浓度；不同大小的核酸在同一浓度的凝胶中迁移率不同，因为分子越大其受琼脂糖的阻力越大，迁移率与碱基对的对数值成反比；同分子量不同构象的核酸迁移率也不同，超螺旋环状DNA迁移率>线状DNA迁移率>带切口环状DNA迁移率。

　　荧光染料溴化乙锭可嵌入DNA堆积碱基间，DNA吸收的254nm的紫外辐射与溴化乙锭在302nm和366nm处的光吸收可在590nm处(可见光红橙区)发光，利于观察，用于核酸凝胶鉴定。

　　一、实验材料

　　琼脂糖、溴化乙锭(10mg/ml)、6×loading buffer、凝胶电泳缓冲液(1×TAE或0.5×TBE)、电泳仪、电泳槽、微波炉

　　50×TAE(储存液)： 242g/L Tris碱

　　57.1ml/L 冰乙酸

　　100ml/L 0.5M EDTA (PH 8.0)

　　6×loading buffer：0.25% 溴酚兰

　　0.25% 二甲苯青FF

　　15%聚蔗糖(Ficoll 400型)(pharmacia)

　　琼脂糖(promega)

　　二、实验方法

　　1．配置凝胶电泳缓冲液，用相应的凝胶电泳缓冲液配置相应浓度的凝胶。

　　2．微波炉加热使凝胶融化，温度降至60℃左右加入溴化乙锭(终浓度为0.5μg/ml)混匀。

　　3．将胶倒入槽中至厚度约3-5mm左右，梳子距槽底1-2mm，并去除气泡。

　　4．倒入凝胶电泳缓冲液，小心拔去梳子。

　　5．DNA样品与6×loading buffer混匀加入凝胶加样孔中，接上电源，电压降采用1－5V/cm，DNA由负极向正极移动。

　　6．电泳一般30分钟足矣，可根据溴酚兰和二甲苯青FF的位置延长电泳时间，电泳完毕，UV下观察。

　　三、注意

　　1．溴化乙锭是强诱变剂兼有中毒毒性，使用时必须戴手套。

　　2．不同的DNA样品需不同的电泳方案，需参见文献。本文为一般常用法。