做HPLC分析时，遇到溶剂效应现象咋办？

  做过HPLC的朋友都知道一句话：用流动相溶解样品（等度洗脱），或者是用初始流动相比例溶解样品（梯度洗脱）。为什么要这么做呢？

我们先来看一个列子：当用100%的乙腈来溶解样品上机时，峰1出现分叉、展宽，峰2未分叉。当换成用流动相来溶解样品时，峰1和峰2的峰形都不分叉，峰形较好。是什么原因导致这种现象发生的呢？那就是溶解效应造成的。

溶剂效应：就是指样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时可能会造成的峰展宽、峰分叉现象。通常表现为色谱图上较早洗脱的峰前沿或者开叉，与此同时较晚洗脱的峰则较为正常的现象。例如样品溶液的溶剂是100%乙腈（100%的强溶剂），而流动相的组成则较弱，20%的乙腈与80%的水。第一个峰是开叉的，并且与第二个峰相比，明显地变宽了。当样品溶液的溶剂变成流动相时，所有的峰形都改善了，且变得尖锐。

当溶解样品的溶剂不同于流动相时，样品溶剂与流动相发生混合，样品溶剂被大量的流动相稀释。如果样品溶剂的强度高于流动相，部分样品在瞬间会表现为在较强溶剂中，并以较快速度通过色谱柱。表现在色谱图上就是∶色谱峰的保留时间缩短。另一部分样品被流动相稀释，在色谱柱上进行充分的保留和洗脱过程，致使这些分子与溶解在强溶剂中的分子通过色谱柱的速度发生变化，使峰形扭曲，发生变形。洗脱较早的色谱峰峰变形要比洗脱晚的色谱峰严重。

那么如何判断分叉的峰是否由溶剂效应造成的呢？

第一种方法就是通过HPLC仪器比对一下两个劈叉峰的紫外吸收波谱，看看他们是否能*一样的UV特征吸收；第二种方法就是将进样体积调小（0.2μL），观察峰是否好转。如果满足以上两个条件，基本可以肯定是溶剂效应造成的。

产生原因1，样品溶液的溶剂很可能强于流动相。例如样品溶液的溶剂是100％乙腈（100％的强溶剂），而流动相的组成则较弱，20％的乙腈与80％的水。

产生原因2，就是进样量比较大。

产生原因3，样品的pH值与HPLC流动相pH悬殊。比如酸性流动相体系，样品pH偏碱性（pH=9）,这种情况下也很有可能发生其实上面三个原因归结起来就是一个原因，那就是样品的溶剂与流动相存在一些不一样，当样品进入流动相的时候，由于这种巨大的差异，一部分样品溶解进入了流动相，一部分还留在进样的溶剂里面，所以在HPLC上出现了保留的差异，所以要解决这个问题的最佳方案就是，使用流动相的起始梯度溶解样品。

特别要说明的一点，如果用强于流动相的溶剂来溶解样品，进样量较小时，也不一定会出现溶剂效应现象。这是因为进样量较小，进样时样品溶液瞬间被大量的流动相所稀释，被稀释的样品在柱子上有很好的保留和洗脱过程。

如果由于溶解度的问题，不得不改用其余的溶剂，那就只能降低进样体积来解决，比如 5μl，1μL。