ELISA的操作过程

    ELISA中主要的试剂有抗原（体）、酶标抗原或抗体、酶和底物等，抗原和抗体是所有的免疫学反应中都必须具备的。酶标抗原或抗体是ELISA的 核心试剂，这些试剂可以自己制备也有商品试剂（例如酶标二抗）销售。在自己制备酶标物时，除了应准备好纯化的抗原和抗体外，还应准备好纯化的酶，酶可以从 动植物组织或微生物中提取，但过程负载，而且纯度和活性通常很难保证，因此从试剂公司公司购买。酶和抗原或抗体链接方法的基本原理和酶固定化方法的原 理相同，常用的方法包括；以戊二醛为教练剂的戊二醛法和过氧酸盐为氧化剂的过氧酸氧化法等。ELISA中常用的酶包括辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase,HRP),碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase AP)、葡萄糖氧化镁(Glucose Oxidase GO)、Bβ-D-半乳糖苷酶和脲酶等，其中HRP和APzui为常用。HRP的底物很多，在ELISA中常用是邻苯二胺与双氧水、5-氨基水杨酸与双氧水等；AP常用的底物是对硝基酚磷酸酯和酚酞单磷酸酯等。

ELISA的种类很多，不同ELISA的具体操作过程不*相同，但是基本过程是一致的。下面以简洁竞争ELISA测定黄曲霉毒素B1为例，对ELISA的具体操作过程叙述如下。

1. 抗原包被（antigen coating)将AFB1与牛许晴白蛋白（BSA)的练街舞AFB1-BSA（也可以是卵清蛋白的练街舞AFB1-OV)溶解于0.1mol/L pH9.5的碳酸盐缓冲液中奖溶液加入酶标板的微孔内，通常每孔加200ul，4℃放置过夜，去除恢复至室温，倾去微孔内溶液（包被液），已含有0.05%的TWEEN-20的PH7.0、0.05mol/L磷酸缓冲溶液生理盐水(PBST)满孔洗涤3次，每次5min，控干，即得到包被有AFB1-BSA的酶标板。在这个过程中AFB1-BSA通过物理吸附包被（粘附）在酶标板微孔的内壁上，没有包被的抗原被洗涤去除。
2. 包被抗原的浓度对ELISA的测定结果由较大的影响，浓度过高或过低都会影响测定结果，如下图是不同包被浓度时，竞争ELISA的抑制曲线。在图中可以看出，包被浓度对灵敏度的影响较大，当包被浓度为5ug/ml时，灵敏度（zui小检出量）达1.57ng/ml,其他浓度的灵敏度都比该浓度的差，这说明5ug/ml是叫合适的包被浓度
   

从 宏观上看，包被浓度无论是过高还是过低都表现为灵敏度差，但是从微观上分析，他们的情况是不同的，低包被浓度时，包被抗原的量不足，微孔内吸附的抗原量 少，可供抗体结合的抗原决定簇少，从而影响灵敏度高；二高浓度时包被抗原的量过多，微孔内吸附的抗原包被抗原进一步和抗体结合，降低了灵敏度，因此只有合 适的包被抗原浓度，才能得到的灵敏度。这种关系见下图

1. 封阻 所谓封阻是指酶标板被抗原包被后，在微孔中加入一定浓度BSA、OV、明胶或脱脂牛奶等溶液以封阻微孔内没有被抗原包被的空袭，避免抗体非特异性吸附于这些空袭，以提高实验结果的准确性和可靠性，常用的封阻剂包括BSA、OV、明胶和脱脂奶等，其中以脱脂牛奶较为便宜，而且封阻效果和其他几种封阻剂没有明显的差别。
   
2. 抗原抗体竞争反应 在酶标板的每个微孔中加入一定量的适当稀释度的抗体（抗血清），同时分别加入一定量的准溶液用于做标准曲线，混匀，37℃保温1-2H，包被在酶标板上的固定抗原（AFB1-BSA)和添加的AFB1标准品或样品抽提液中的AFB1游离抗原竞争抗体的结合位点，PBST洗涤扣干3次，游离的抗原抗体符合无被洗涤去除。
3. 酶标二抗与抗原抗体复合物的反应 将一定量的适当稀释的酶标二抗溶液加入个反应孔，37℃保温1-2h，酶标二抗和抗原抗体符合无反应，形成抗原-抗体-酶标二抗的复合物固定在酶标板上，PBST洗涤扣干5次，将有力多余的酶标二抗去除。
4. 底物显色反应和吸光值的测定 每孔加反应底物100ul（40mg临本二胺溶于100ml、PH5.0/0.2mol/L柠檬酸0.1mol/l磷酸氢钠缓冲溶液，加入150ul H2O2,现配现用，37℃保温保湿，避光反应30min，每孔加50ul 2mol/L,H2SO4终止反应，5min后，以酶联免疫测定仪于490nm测吸光度。

6、Elisa竞争抑制曲线 以AFB1标准误溶液中的AFB1的浓度对数为横坐标，以不同AFB1浓度所对应的吸光值和AFB1浓度为零时吸光值的比值的百分数（称为竞争抑制率）为纵坐标，绘制ELISA竞争抑制曲线，根据样品抽提液的吸光值，利用竞争抑制曲线，计算出样品中AFB1的含量，上述就是ELISA的操作过程.