链cDNA合成试剂盒

产品名称:链cDNA合成试剂盒

英文名称:RT EasyTM（For first-strand cDNA synthesis）

产品规格:25 rxns 100 rxns

产品货号:RT-01011

保存说明:短期室温，长期2-8℃

产品描述:用于长cDNA合成或者客户特定引物RT反应

英文名称:RT EasyTM（First-strand cDNA for Real Time PCR）

产品规格:50 rxns 200 rxns

产品货号:RT-01021

产品描述:链合成，添加2种引物，用于Real Time PCR

链cDNA合成试剂盒注意事项:

1、确保RNA完整性及纯度。RNA质量是决定合成cDNA链成功的关键因素,其纯度及完整性可由OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。较纯的RNA样品OD260/OD280比值通常为1.8-2.0,若该比值偏低,应进一步纯化。真核生物RNA样品电泳图谱28s和18s的比值约为2:1,否则,表明有RNA降解。

2、避免RNA酶污染。进行cDNA合成所用的器皿、试剂和溶液必须*无菌。操作过程始终戴手套以杜绝各种RNA酶的污染。

3、 合成cDNA链的引物选择。选择oligo(dT)12-18作为反转录引物,可保证cDNA具有完整的3’-端,通常可得到接近全长的cDNA链;若选择随机寡核苷酸(dN)6或(dN)9作为引物,引物在整个mRNA的多个位点退火,产生短的部分长度的cDNA链。这种方法经常用于获得5’末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。

链cDNA合成试剂盒操作方法:

1、 逆转录反应 

(1) 在无菌薄壁管中加入以下成份:

Total RNA   0.5-1.0µg

(dN)9 or oligo(dT)18  100pmol

(2) 混匀后,70℃变性5min,将薄壁管迅速置于冰上冷却,然后依次加入以下成份:

5×M-MLV Buffer     4µl

dNTPs(10mM each)    1µl

RNasin        10U

100mM DTT       2µl

M-MLV Reverse Transcriptase  100U

DEPC-treated water    up to 20µl

（3） 混匀后短暂离心，使用oligo(dT)18引物时在42℃，使用随机引物(dN)9时在37℃下温育1小时。

(4) 94℃ 5min终止反应后,冰上冷却。

(5) 合成的cDNA链可直接用于PCR扩增或进行其它下游操作。