碱性磷酸酶标抗体制备技术的标记步骤

    碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP），系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。从小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6；从大肠杆菌中提取酶分子量为80kDa，最适pH为8.0。它的作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐（PNP）、β-甘油磷l酸钠、磷酸萘酯等。AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。AP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。

    碱性磷酸酶标抗体制备技术的标记步骤

    （1）取抗体（2～5mg/mL）1mL，加入AP5mg溶解。

    （2）装入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，换液3次。

    （3）加入2.5%戊二醛20uL，室温（20℃±）放置2h。4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析过夜，换液3次。

    （4）移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。

    （5）取出标记抗体，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。

    （6）加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量（0.1mL）分装，4℃保存（使用前以pH7.4PBS-吐温溶液将结合物适当稀释）。