质粒提取实验常见问题分析

　　质粒提取原理

　　现在较常用的质粒提取方法有三种:碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法，前两种方法较为剧烈，适用于较小的质粒（＜15Kb），而去污剂裂解法则比较温合，一般用于分子量较大的质粒（＞15Kb）。

　　碱裂解法是一种广泛使用的制备质粒DNA的方法。其原理为：染色体DNA远远大于质粒DNA，染色体DNA为线状分子，而质粒为共价闭合环状分子。当pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子的染色体DNA完quan变性，而共价闭环质粒DNA在将PH调至中性后即可以恢复其天然构象，在高盐浓度存在的条件下，染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA仍在上清中。

　　质粒提取常见问题分析

　　1、影响质粒提取的因素有哪些？

　　质粒提取的得率和质量与很多因素有关，如宿主菌的种类和培养条件、细菌细胞的裂解、质粒拷贝数、质粒的稳定性、抗生素、吸附膜的吸附能力、提取操作的熟练程度等等。

　　2、为什么从革兰氏阳性菌中提取质粒要在悬浮液中加入溶jun酶？

　　革兰氏阳性菌有一层细胞壁，必须加入溶jun酶才能使之溶解。

　　3、如何根据实验需要选择不同级别的产品？

　　从纯度上：各种常规操作,包括酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化，普通纯度的质粒可以满足要求；而对于转染实验，则要求使用高纯度质粒提取试剂盒方能满足要求。

　　从提取的量上：1-20μg，应选择小量提取试剂盒；20-40μg，应选择中量提取试剂盒；大于40μg，应选择大量提取试剂盒。

　　从宿主菌上：分为普通细菌质粒提取试剂盒、G+菌质粒提取试剂盒和酵母菌质粒提取试剂盒，根据情况进行选择。