镍-琼脂糖凝胶 H.P.使用方法及注意事项

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镍-琼脂糖凝胶 H.P.参数说明

中文名：镍-琼脂糖凝胶 H.P.

英文名：Ni Sepharose H.P.

供应商：上海远慕

产地：进口，国产

工作PH值：3-12

结构成分：6%交联琼脂糖

平均粒径：34µm

操作温度：4-30℃

配基基团：Ni2+

配体密度：15μmol/ml

保存温度：4℃

凝胶类型：小配体亲和色谱填料

性状：凝胶状，保存在20%酒精溶液中

应用：分离带His标签的重组蛋白及能被金属离子吸附的多肽、蛋白、核苷酸、磷酸化蛋白，高分辨率。

镍-琼脂糖凝胶 H.P. 使用方法及注意事项说明

镍-琼脂糖凝胶 H.P. 说明

镍-琼脂糖凝胶 H.P. 是用于纯化6×His标签重组蛋白的一种纯化介质，它是由6%交联的Sepharose耦连了一种四齿螯合剂NTA而得；它可用于在非变性或变性条件下纯化任何表达系统表达的6×His标签重组蛋白。NTA，含有四个螯合区，较一般的三齿螯合剂能更好的结合Ni2+；6×His可与Ni2+螯合，从而使His标签蛋白结合在Ni-NTA纯化介质上，未结合的蛋白被洗涤下去，结合在介质上的蛋白经过一定浓度的咪唑或低pH缓冲液的温和洗脱下来，从而得到高纯度的目的蛋白；该纯化介质与His标签蛋白具有*的亲和力，可达5-20 mg/mL。可在非变性和变性条件下纯化任何表达系统所得的His标签蛋白；纯化程序简单，所得的蛋白纯度可高达95%；Ni-NTA可再生4-6次，重复使用。本产品悬浮液为20%乙醇，已螯合Ni2+。

镍-琼脂糖凝胶 H.P. 使用方法

1、乙醇浸泡：在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干;

2、无盐水浸泡：室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的*溶胀，然后;

3、盐酸浸泡：在常温下再用0.2NHCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗只中性;

4、将溶胀好的凝胶脱气后(真空抽滤或超声波)根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层;

5、上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止(流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值);

6、凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整;脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50cm以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免；难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1即可;

7、洗脱方法：可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱;在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以*分离纯化;

8、在位清洗(CIP)凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白；方法是以40cm/h用1M氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。

镍-琼脂糖凝胶 H.P. 注意事项

1、一般都用药匙取用。药匙的两端为大小两个匙，分别取用大量固体和少量固体。

2、试剂一旦取出，就不能再倒回瓶内，镍NTA琼脂糖凝胶6FF可将多余的试剂放入容器。

3、称量的天平应保持清洁、干燥，避免潮湿及腐蚀性气体的侵蚀。在进行称量操作时，被称取的试剂应置于称量纸上或其它器皿内，不可在盘中直接称量。

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