士锋DNA分子转化

体外通过基因工程手段所构建的含目的基因的重组质粒,选用转化和筛选技术,可获得含重组的阳性克隆.在此阳性克隆中,DNA可在生物体系中大量扩增,繁殖,保存以及表达目的基因的产物,这是PCR体外扩增DNA所不能替代的.配合DNA重组技术,所获得的,不同目的需要的阳性菌株已广泛应用于科研,医药生产和生物发酵等领域.

质粒转化不同细菌有不同的转化效率,转化效率的高低与实验的成败直接相关, 通常转化效率可达105-107转化子/μg DNA.获得高转化效率的关键是感受态体菌的制备.感受态就是细菌吸收转化因子的生状态,只有发展为感受态的细胞才能稳定摄取外来的DNA分子. pUC18的LacZ基因区域当有dna片段插入时,LacZ基因失活,转化进入大肠杆菌并在含有IPTG和X-gal培养基生长时,会产生白色的克隆,不含插入片段的pUC18质粒进入宿主细胞生成蓝色菌落.

DNA分子转化分以下几步：

1、 吸附--双链DNA分子吸附于受体菌表面;

2、 转入--双链DNA分子解链.一条链进入受体菌,另一条降解;

3、 自稳--外源质粒dna分子在细胞内复制成双链;

4、 表达一供体基因随同复制子同时复制,分裂, 转录翻译.

实验试剂：

LB培养基

质粒DNA(含Amp抗生基因),受体菌

CaCl2 0.1M

Amp

实验过程：

1、感受态细胞制备及CaCl2处理：

1) 将宿主菌在琼脂培养基平板上划线,37℃培养16～20小时.

2) 挑取单菌落转入20mL LB培养基锥瓶中,37℃振荡过夜.

3) 从中取2mL菌液转入50mL LB培养基中37℃振荡培养4-5小时,测OD100达0.4～0.5.

4) 培养物于冰上10分钟.

5) 转入-50mL离心管,于4000rpm下4℃离心10分钟.

6) 弃上清,倒置离心管1分钟,流尽剩余残液然后加入10ml用冰预冷的 0. 1mol/L CaCl2,置冰上10分钟.

7) 4,000rpm 4℃离心10分钟,弃上清.

8) 加入2ml,0.1M CaCl2悬浮细胞,于4℃过夜.