质粒DNA的提取详细步骤

碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已*分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

(一)仪器
1．恒温培养箱
2．恒温摇床
3．小型高速离心机
4．高压灭菌锅
(二)材料
1．带有pQE-31质粒和pUC18-CAT质粒的两株大肠杆菌
2．1.5mL 离心管
3．枪头、枪
(三)试剂
质粒小量制备试剂盒(3S Spin plasmid MIniprep Kit V3.1,申能博彩公司)

试剂盒的参考配方:
Solution I
50mmo1／L 葡萄糖
5mmo1／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris·HCl(pH8.0)
1.0 mmo1／L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
Solution II
0.4mo1／L NaOH，2％SDS(十二烷基硫酸钠)，用前等体积混合
Solution III
5mo1／L 醋酸钾 60 mL
冰乙酸 11.5mL
水 28.5mL
TE缓冲液
10mmo1／L Tris·HCl
1mmo1／L EDTA(pH8.0)
胰RNA酶(RNA酶A)
将RNA酶溶于10mmo1／L Tris·HCl(pH7.5)、15mmo1／L NaCl中，配成10 mg／mL的浓度，于100℃加热15min，缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

[实验步骤]
(一)提取质粒
将3mL含Apm的LB液体培养基加入到两支试管中，分别接入含pQE-31质粒和pUC18-CAT的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。
以下的操作按试剂盒的说明书进行。(附试剂盒说明书)
(二)质粒的琼脂糖凝胶电泳
将5mL洗脱液与3mL的DNA样品缓冲液混合，加于1.2% Agarose 做凝胶电泳分析。

附：试剂盒说明书

3S Spin Plasmid Miniprep Kit V 3．1

试剂盒组成：
组成 K1910（50次） K1920（100次） K1930（250次） Solution I(a) 5m1 10m1 25m1 Solution II(b) 10m1 20m1 50ml Solution lll 20m1 50m1 2x50m1 Wash Solution (c) 22m1 2x22m1 5x22m1 TE(d) 5m1 10m1 40m1 3S Column 50支 100支 250支 Co11ection tube 50支 100支 250根 说明书 1份 1份 l份
注：
a)Solution I内含RNaseA，每次实验结束后，4℃保存。
b)温度低时，Soluion II有白色沉淀析出，37度以下保温溶解，摇匀后使用。
c)使用前，必须在Wash Solution 瓶中加入50ml无水乙醇，充分混勾后使用。每次使用后将瓶盖旋紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。
d)TE pH8．0或者水均可以用十洗脱，但是用水洗脱DNA，效率通常要低—些。抽提测序用质粒需要用水洗脱。
主要特点：
● 采用改良的碱裂解方法，质量稳定，重复性好。
● 经济快速，每个抽提可以在20分钟内完成。
● 无需酚抽提，无需乙醇沉淀，无需CsCl离心。
● 质粒纯度高，洗脱体积小，适合于DNA全白动荧光测序。

实验操作步骤(从细菌中抽提质粒)

1．将过夜培养的2m1细菌，测序用质粒抽提请用5m1细胞，高速离心1分钟，*去除上清。
2．加入100ml solution I，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
注意：对于低拷贝数的质粒，请用5m1细胞；
质粒如果用于全自动荧光测序分析，请用5ml细胞，无需提高SolutionI，II和III的用量。
3．加入200ml Solution II，立即上下颠倒或用手指弹管底，使细菌裂解，室温放置(2分钟左右)至溶液变成澄清。
4．加入400ml Solution III，立即上卜颠倒5—10次，使之充分中和，室温放置2分钟。
注意：步骤2和3在冰上操作效果更佳。
5．高速离心，15，000转／分钟，10分钟。无需低温离心。
注意：提高离心速度，使沉淀更加紧密，步骤6操作取上清更为方便。
6．取出2m1样品收集管和3S柱，在管壁标上样品号，将步骤5中的上清全部转移到(吸或倒入)3S柱里。盖上离心管盖子(盖子也可以不盖，但是如果您同时有很多样品，担心混淆或弄翻溶液，建议您盖上盖子)，室温放置2分钟 (室温放置时间不重要，可长可短)；用台式离心机室温高速(12，000转／分钟)离心1分钟。
注意：转移上清时不要吸取沉淀，否则会出现Genomic DNA和蛋白质污染。
离心管盖子盖上时，柱子内压的增加，可能会使部分溶液从柱子底部流出，为正常现象。
7．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同一支收集管中，吸取700ml Wash Solution到3S柱，离心1分钟。
8．重复步骤7一次。
9．取下3S柱，弃去掉收集管中的废液，将3S柱放入同—支收集管中，高速离心2分钟。
10．将3S柱放入干净的1．5m1的离心管中，在3S柱子膜中央加 50ml TE或水，不要盖上离心管盖, 室温下放置2分钟；盖上离心管盖，室温高速离心1分钟。
注意：将TE或水预热到50℃左右可以提高洗脱效率。测序用质粒用30ml预热的水洗脱，浓度一般满足测序要求。
11．洗脱的质粒可以立即用于各种分子生物学操作或-20℃保存备用。lml过夜培养细胞，质粒如果用50ml水洗脱，通常情况下可以取10ml洗脱液做Agarose电泳或酶切分析。