定量PCR实验简明操作

定量pcr实验简明操作
2 x taqMan Universal PCR Master Mix
20 x TaqMan Gene expression Kits

1. 模板、引物及探针用量
DNA用量：10 ~ 100 ng 每反应；
cDNA用量：1 ~ 100 ng 总RNA反转录所得cDNA取1 μL。
引物和探针用量：
定量PCR实验简明操作

2．TaqMan探针法PCR反应
定量PCR实验简明操作
总体积 20
PCR循环参数：
50 °C 2 min → 95 °C 10 min → (92 °C 15 sec → 60 °C 1 min) × 40个循环

3．SYBR Green I荧光染料法PCR反应
定量PCR实验简明操作

PCR循环参数：
50 °C 2 min → 95 °C 10 min → (92 °C 15 sec → 60 °C 1 min) × 40个循环

5．7000 SDS v1.0软件操作
检查电脑与仪器的联线是否正常，电脑应处于外接电源供电状态。开电脑，待桌面图标出现后，再打开7000主机电源，然后启动SDS应用软件。
新建文件 菜单File → New，Assay选择Absolute Quantification (实时定量模式)，打开一个空白文件。
探针设置 双击任意一个孔，打开Well Inspector窗口。该窗口也可以从菜单View → Well Inspector打开。
使用软件，或者探针（Detector）没有设置好，请点击Add Detector按钮，打开Detector Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Detector Manager打开。如果Detector列表中没有合适的探针，点击按钮File → New，新建探针：设定探针的名称(建议使用所研究基因符号加标记荧光，如GAPDH_FAM、ACTIN_VIC等)、报告基团(FAM或者VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA；MGB探针选None)、颜色(任意)等。设置完成后点击OK，该探针即出现在探针列表中。重复设立其他的探针。