cDNA的筛选

（一）λgt11 cdna文库铺平板
宿主细菌制备
1.用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml lb培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。
2.将过夜培养物以3000×g离心5min。
3.分别用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol/L MgSO4; 高压灭菌）重悬细胞沉淀。
4.细胞悬液可用于4℃贮存至一周。

预制噬菌体悬液铺平板
以已知滴度（如，已知每ml噬菌体颗粒数）的cDNA文库或其他噬菌体悬液开始，用λ－dil稀释以达到所需每平板噬菌体数。每个90mm直径平皿5×103个噬菌体/100μl开始筛选。

铺平板
1.将所需数量的LB平板置42℃温箱预热。
2.LB顶层琼脂（每平板zui少2.5ml）用微波炉熔化，然后置49℃水浴中。
3.为温箱内的每一个平板准备一个12ml带螺旋盖试管，于室温，放在合适的架子上。
4.用移液器每管加100μlλ－dil稀释的宿主细胞悬液。
5.每管加100μl稀释的噬菌体悬液与细菌于漩涡器上简短混合。
6.含细菌和噬菌体（感染混合物）的试管于37℃温育25min，然后室温放置。
7.用一支消毒的10ml 玻璃移液管在本生灯火焰上稍稍预热，取2.5ml保存在49℃的熔化顶层琼脂加到一支含感染混合物的试管内。
8.立即在手掌之间滚动混合管内混合物，然后均匀地倒入一个预热的LB平板上。
9.倒好的平板于室温置水平面上直至顶层琼脂凝固（至少5min）。
10. 重复步骤7至9，直至所有的细菌和噬菌体混合物都铺平板。
11. 平板置42℃温箱（对λgt11）直至噬菌斑长出。

（二）杂交筛选——cDNA序列作为探针

4.膜剥离：首先，用软铅笔在干的硝酸纤维素滤膜上给准备影印的平板编号。其次，从平板的中央开始向边缘小心将滤膜铺在菌台上。当滤膜*变湿后（颜色变灰），再等30s。同时，用针头在平板上标出滤膜的3个不对称位置。小心将滤膜从平板上剥离，接触面向上放在一张干净的Whatman 3MM滤纸上。在进行下一步骤之前，所有的平板重复步骤4。
5.将滤膜接触面向上漂浮在变性液（0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol/L NaCl）中5min。
6.中和5min。
7.用2×SSC洗涤5min。
8.将滤膜放在一张新的Whatman 3MM滤纸上，用铅箔将滤膜和滤纸一起包住。
9.在真空炉中80℃烘烤2h。
10. 用6×SSC预先短暂地湿润滤膜，然后用预洗液（50 mmol/L Tris-Cl pH8.0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0.1% SDS）于68℃预洗涤至少1h。用一个盘子放在水浴摇床上。
11. 将25张滤膜转移到一个装有 50ml杂交液（5×SSPE；1×Denhardt’s液；100μg/ml cT-DNA；0.1％SDS）的贮存罐内（直径至少90mm），68℃预杂交2h。
12. 对于每ml杂交液，2倍的105至1×106cpm的双链探针经沸水浴变性10min后，迅速放冰上冷却。
13. 变性探针立即加到预杂交混合液中。
14. 在封口的贮存罐内于68℃杂交过夜，不断地晃动以防滤膜粘在一起。
15. 杂交结束后，滤膜用2×SSC，0.01％SDS于室温洗涤3次约1h。
16. 将潮湿（防止干燥）的硝酸纤维素滤膜放在一张硬纸或X光片上，用放射性墨水在针头标签上作标记。
17. 滤膜用塑料包装袋（如Saran）包住，然后加上增感屏在X光片上于－70℃曝光