PCR技术在DNA工程中的应用

引言

对DNA片段在按特殊要求进行修饰上PCR技术提供了一种比原有技术更快更简单的 方法。因为与重组DNA技术相比，PCR技术本身就较为简单;而且它还可以通过化学合 成寡聚核苷酸引物的方法更为简便地改变DNA的碱基序列，而不需对DNA片段进行限制 性内切酶和连接酶操作;再者，PCR技术还可能很方便地进行序列改造，如在引物5"端 加上一个“添加”序列(add-on sequences)。此外PCR技术产生的修饰产物效率几乎 可达100%。

Scaharf等人首先提出PCR技术可以很方便地将酶切位点导入DNA片段中，这只需 将这些序列加到寡核苷酸引物的5"-末端上。虽然这些序列与模板DNA是不朽对的，但 在大多数情况下，它们几乎不影响扩增的特异性和扩增效率;特异性显然是由内引物 的3"-末端决定的。当带有这些“添加”引物的DNA链进行在我复制时，这些添加的内 切酶位点序列也就“安装”到由此而扩增出的PCR片段中，目前已有人报道长达45个 碱基的添加序列。

通过PCR引物引入DNA序列变异的原理是非常有用的。zui为简便的是它可以使PCR 产物的一条链或另一条链或两条链都特异性地标记上放射同位素、生物素或荧光素。 它还可以在DNA序列的任一位置上进行改变，或用来在任何所需的连接点进行DNA序列 的重组。本章主要就是讨论这些步骤。

用引物标记PCR产物

用γ-32P-ATP直接将一个PCR引物磷酸化(Kinasing reaction)，然后在标准PCR 反应中直接使用标记的引物来扩增出一端带有标记的片段。将这种末端标记法应用到 通过Maxam-Gilbert或磷酸硫代化学法对产物进行直接测序，以及合成一些适用于进 行蛋白质的结合/保护分析(binding/protection assays)或“足迹法”的DNA序列。PC R技术是一种在体外合成用于蛋白“足迹法”分析所需DNA片段的简便方法。蛋白“足 迹法”分析不依赖限制性内切酶位点并且比限制性内切酶位点并且比限制性内切酶片 段的分离和末端标记更为简便。

生物素可以标记到一个寡核苷酸引物的5"-末端上，其结果并不影响PRC反应。这 为用抗生蛋白链菌素─或抗生物素蛋白─酶共扼物检测杂交PCR产物提供了一个非同 位素法，它还可以用抗生蛋白链菌素柱(Streptavidin─columns)将产物的一条链与 另一条链分开;此外，它还可以对PCR产物进行定量。同样，也可制备用荧光标记的寡 聚物并应用在PCR技术中。带有不同荧光标记的特异性引物可以区分从不同位点扩出 来的PCR产物。

在PCR产物的末端导入有用序列

如图1所示，内切酶的识别位点可被加到单个或两上PCR引物的5"端上。这些位点 有助于扩增片段插入到克隆载体中。在扩增产物的两端加上不同的酶切位点，产生的 特异性的粘性末端就可直接进行克隆转化。在设计“添加”内切酶位点的序列时，zui 好在标准识别序列的5"末端另外再多加几个碱基，以免处于片段zui末端的酶切位点可 能不被内切酶所识别。文后的操作指南A就是关于将PCR产物的这种位点上进行酶切， 并用连接酶将产物插入克隆载体的操作步骤。用这种方法加到PCR片段的其他序列还 有RNA聚合酶的启动子。这些富含G+C序列是为了增强变性梯度凝胶电泳的分辩力，以 使它能区别出单碱基差异的不同片段。

由PCR产生的突变和重组

Mullis等指出PCR技术可以用来“装配”重叠寡核苷酸使之成为很长很长的PCR产 物，从而获得比用直接化学合成法具有更多产量的全合成DNA模板的两年PCR产物准确 地连接起来。如图二所示，从同一模板的不同区域扩增出来的两个PCR产物，经过这 样处理后，得到的片段在序列上能相互重叠。这些产物可经过混合，变性及退火。在 异源双链中有一条链在3"-末端发生重叠，利用与其5"-末端配对的引物，来扩增这个 异源杂合双链，我们就可以从由两上次级PCR产物准确地连接成的片段混合物中调出 一个片段(按Mullis的说法)。由于特生的扩增，PCR反应中的绝大多数产物是我们所 需的重组DNA片段。

通过引物导入的序列变异因化学合成的引物长度有限而受到限制，但此法与PCR 片段连接法组合使用，可在片段的任一位置引入变异，而不仅仅是在其末端引入。重 组所需的重叠序列不必存在于天然模板，可设计成添加序列进入引物。这样，通过 PCR技术几乎可在DNA片段任何位置上特异性地进行位点替代、缺失和插入，同时它还 可以将本来毫不相关的序列准确地连接起来。