士锋蛋白定量Commassie法和BCA法比较

Commassie法（Bradford法）：

原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料G-250结合，颜色从棕色变为蓝色，在595nm处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。

BCA法：

原理：在碱性条件下，蛋白将Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。

现对这两种方法进行比较：

一、实验材料：

细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103）

M231

BCA蛋白定量试剂盒（AR0146）

Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒（AR0145）

二、操作步骤：

Commassie法：

1.将BSA冻干标准品（10mg/支）用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。

2.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

3.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。

4.滴加200ul考马斯增强型试剂（溶液A）至每孔混匀并充分震荡30S

5.停止震荡，在室温孵育样品10min

6.在酶标仪中测量595nm时的吸光值。

7.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

BCA法：

1.按50体积BCA试剂A加入1倍体积BCA试剂B配置适量BCA工作液，充分混匀。

2.将BSA冻干标准品（10mg/支）用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625 ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。

3.M231用细胞总蛋白提取试剂提取总蛋白。

4.各取20ul蛋白标准品和待测M231样品至相应标记的微孔板中。

5.滴加200ulBCA工作液至每孔混匀并充分震荡30S

6.停止震荡，在37度孵育样品30min

7.在酶标仪中测量562nm时的吸光值。

8.绘制标准曲线，再用标准曲线判断出样品的蛋白浓度。

三、实验结果

 
其中1到8为2000ug/ml，1000,500,250,125,62.5,31.25,15.625的标准浓度的BSA蛋白，9为空白孔，样品1为8倍稀释M231总蛋白，样品2为32倍稀释M231总蛋白

Commassie法： 

 

为了测试准确，应在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是zui稳定的。 由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.4mg/ml

Commassie法优点是：

1.灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其zui低蛋白质检测量可达1ug。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

2.测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性。

3.干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

1.由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M的NaOH。（如同0.1M的酸干扰Lowary法一样）。

3. 标准曲线也有轻微的非线性，在0-1000ug/ml浓度范围内有较好线性。因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
BCA法： 
 

由标准曲线可以算出样品原始浓度为14.28mg/ml

BCA法特点：    1. 灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml，zui小检测蛋白量达到0.5μg，待测样品体积为1-20μl 。    2. 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容样品中高达5%的SDS，5%的Triton X-100，5%的Tween 20，60，80。    3. 在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。    4. 检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。  5. 受螯合剂和略高浓度的还原剂的影响：EDTA小于10mM。DTT小于1mM巯基乙醇低于1mM

BCA法和Commassie法各有优势，在不知道蛋白样本缓冲液成分的情况下可以两种方法配合使用，以消除定量的误差。