植物原生质体融合与体细胞杂交：聚乙二醇法诱导原生质体融合

一. 实验目的
了解用聚乙二醇PEG方法诱异同种植物原生质体融合的技术，并能根据新本原生质体的形态樗来鉴别杂种细胞。
二. 实验原理
不同种植物的原生质体可在人工诱导条件下融合，所产生的杂种细胞，即异核体经过培养可再生新壁，分裂形成愈伤组织，进而分化产生杂种植株。由于进行融合的原生质体来自体细胞，故该项技术也叫体细胞杂交。原生质体融合能使有性杂交不亲合的植物种间进行广泛的遗传重组，因而在农业育种上具有巨大的潜力。在植物遗传操作研究中也是关键技术之一。
人工诱导原生质体融合可使用物理学方法，如运用细胞融合仪，在电场诱因导下实现融合，然而至今广为使用的仍是聚乙二醇（PEG）溶液引起原生质体的聚集和粘连，然后用高pH钙溶液相处理的化学方法（Kao等，1974）。该法应用分子量至为1500~6000的聚乙二醇（PEG）溶液引起原生质体的聚集和粘连，然后用高pH的钙溶液稀释时，就产生了高频率的融合，融合的频率和省略常与所有PEG的分子量、浓度，作用时间，原生质体的生理状态与密度以及操作者的细心程度有关。
三、实验材料与仪器
1． 实验材料：
烟草或其它植物无菌苗的叶片。
胡萝卜肉质根诱导的松软愈伤组织或悬浮培养细胞。
2．试剂
2.1 酶液及洗涤液，同植物原生质体的分离和培养实验。
2.2 PEG溶液

Tris(缓冲液) 0.05mol/L
PH调至10.5
2.4 DPD培养基同植物原生质体的分离和培养实验。
四、实验方法
所有操作均在超净工作台上进行。
1． 原生质体的分离和收集。参看植物原生质体分离和培养实验。
2． 将收集的两种不同材料的原生质体分别悬浮在0.16mol/L的CaCl2·2H2O（pH5.8~6.2）原生质体密度调整为2×105/ml左右（用血细胞计数板统计原生质体密度）。
3． 将两种原生质体悬液等量混合。
4． 用刻度吸管将混合的原生质体悬液滴在直径为60mm的平皿中，每皿滴7~8滴，每滴约
0.1ml。然后静置10in，使原生质体巾在皿底上，形成一薄层。（应有3~5个平皿的重复）。
5． 用吸管将等量的PEG溶液缓慢地加在原生质体液滴上，再静置10~15min。此时可取一个平皿在倒置显微镜上观察原生质体间的粘连。
6． 用刻度吸管向原生质体液滴慢慢地加入高pH、商钙稀液。*次加0.5ml，第2次1ml，第3、4次各2ml，每次之间间隔5min。
7. 将平皿稍微倾斜，吸去上清液，再缓缓加入4ml稀释液。5min后，再倾斜平皿，吸去上清液注意吸去上清液时勿使原生质体漂浮起来。
8. 用DPD培养基如上法换洗二次。
9. 每平皿中加培养基2ml，轻轻摇动平皿。
10.用蜡膜密封平皿。置260下进行24h暗培养，然后转到弱光条件下培养。
实验结果
1． 在倒置显微镜下观察异源融合。在培养3天以内，可根据双新原生质体的形态特征来鉴别异核体。因为来自叶肉组织的原生质体具有明显绿色叶绿粒，而来自培养细胞的原生质体无色，但具浓密原生质丝，并可看到显示的核区。
2． 统计异源融合的频率