士锋生物PCR实验步骤

标准的PCR过程分为三步(如图所示)：

<img alt="PCR步骤" pcr步骤"="" border="1" height="199" data-cke-saved-src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120504/1059292160-0.jpg" src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120504/1059292160-0.jpg" width="141" style="vertical-align: middle; border: 0px;">

1.DNA变性(90℃-96℃)：双链DNA模板在热作用下，

氢键断裂，形成单链DNA

2.退火(复性)(40℃-65℃)：系统温度降低，引物与

DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸(68℃-75℃)：在taq酶(在72℃左右*的活

性)的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延

伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是*也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

循环参数

1、预变性(Initial denaturation).

模板DNA*变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。

2、引物退火(primer annealing)

退火温度一般需要凭实验(经验)决定。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

3、引物延伸

引物延伸一般在72℃进行(Taq酶zui适温度)。

延伸时间随扩增片段长短及所使用Taq酶的扩增效率而定。

4、循环中的变性步骤

循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列*变性：

变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不*，易造成扩增失败。

5、循环数

大多数PCR含25-35循环，过多易产生非特异扩增。

6、zui后延伸

在zui后一个循环后，反应在72℃维持5-15分钟.使引物延伸*，并使单链产物退火成双链。