士锋生物用SDS―聚丙烯酰凝胶电泳法测定蛋白质的分子量

一、原理
SDS 是一种阴离子表面激活剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原； SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质 -SDS 复合物。在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g 蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的 SDS- 复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS 与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质 -SDS 复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm ，而长轴则随蛋白质的 M r 成正比的变化。基于上述原因，蛋白质 -SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关， 也就是蛋白质 M r 的函数。
二、设备
1．垂直板电泳槽一套 2．直流稳压电源（500伏、100毫安）
3．抽气装置 4．10毫升注射器、100微量注射器各一支。
三、试剂
1．丙烯酰胺（Acr）贮液：30克Acr, 0.8克甲叉双丙酰胺（Bis）。加水溶解定容至100毫升，过滤后使用，4℃下可贮藏1-2个月。
2．10%的SDS溶液。
3．10%的过硫酸铵溶液。
4．四甲基乙二胺（TEMED）。
5．分离胶缓冲液：1.0M pH8.8Tris-盐酸缓冲液，将12.1克用水溶解后，用6M盐酸调至pH8.8，用水定容至100毫升。
6．浓缩胶缓冲液，1.0M pH6.8Tris-盐酸缓冲液，将12.1克Tris用水溶解后用6M盐酸调至pH6.8，用水定容至100毫升。
7．电极缓冲液：将30.3克Tris 28.8克甘氨酸和2克SDS用水溶解后定容至200毫升，pH应为8.3，用时稀释10倍。
8．2X样品缓冲液，将2克SDS，5毫升β－巯基乙醇，10毫升甘油，2.0毫升0.1%溴酚蓝和2毫升试剂（6）混合，用水溶解并稀释到50毫升。样品为固体则稀释1倍使用，若为液体，则等量混合。
9．0.1%溴酚蓝溶液。
10．已知分子量的标准蛋白（M﹤10 万）4-6种。
11．未知分子量的蛋白质样品。
12．考马斯亮蓝溶液：称取0.25克考马斯亮蓝R－250，加入45毫升甲醇，10毫升冰醋酸和45毫升水，过滤后使用。
13．脱色液：37.5毫升冰醋酸。25毫升甲醇，加水至500毫升。
14．SDS的重结晶：50克SDS加100毫升无水乙醇，70℃下保温溶解。趁热过滤后，于低温下过夜结晶，过滤，用少量无水乙醇或乙洗涤二次，于真空干燥器内干燥。
四、操作程序
1．电泳槽板的安装（略）
2．制胶
用SDS―聚丙烯酰凝胶电泳法测定蛋白质的分子量

按上表比例配制分离胶，本实验分离胶浓度为12%。混匀后将胶液沿玻璃板壁缓缓地注入已准备好的凝胶模子中，注胶过程防止气泡产生，胶液加到玻璃板顶部3厘米处，立即用注射器覆盖3-5毫米厚的水层，垂直静置聚合。
按上表比例配制浓缩胶，立即将胶液注入胶模内，插好样品梳。样品梳的下端应距分离胶1厘米，浓缩胶高约3厘米，聚合后，小心地取出样品梳。
3．样品处理及上样
准确吸取蛋白质样品0.5毫升，加入0.5毫升的样品缓冲液，在45℃水浴中保温1 小时，或在沸水中加热2-3 分钟，蛋白质在SDS和β－巯基乙醇的作用下，变性，形成紧密的棒状SDS－蛋白质复合物。蛋白质浓度在0.5mg/ml左右为宜。用微量注射器吸取50微升样品。注入点样孔中。
4．电泳，加样后，向两槽内注入电极缓冲液，接通电源，上槽接电源负极，下槽接正极，开始控制电流为15-20毫安，染料进入分离胶后，加大到30毫安，电压在80-120伏。当指示染料到达胶长的四分之三以上时，即可停止电泳，电泳约需3-4小时，若用盘状电泳。当初始电流控制在每管1毫安，样品进入分离胶后，增大到每管2-3毫安，维持恒流，电泳约需3小时。
5．染色 胶取出后，在水中浸泡10分钟，浸出部分SDS，并用细铜丝对溴酚蓝带的位置进行标记，然后浸入考马斯亮蓝R250溶液中，30℃染色1小时，然后用水冲洗去凝胶表面的染料，放入脱色液中，于37℃下脱色1-2天，期间要经常更换脱色液。
五．结果计算
SDS-PAGE 低分子量标准蛋白质
用SDS―聚丙烯酰凝胶电泳法测定蛋白质的分子量
以相对迁移率（mR）为横坐标，相对分子量（Mr）的对数值为纵坐标。
在半对数坐标纸上作图，可得到一条直线，然后根据未知蛋白的迁移率，在半
对数坐标上查出其对应的分子量。
五、注意事项
1．在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水。
2．样品液在加样前需在沸水中加热几分钟。
3．电泳时，电流不可太大，太大会烧胶。电泳一般需要放在冰箱中进行，以便于散热。