士锋生物免疫酶细胞化学—染色方法

一、酶标抗体法

酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。

(一)酶的种类及特点

从理论上讲，用细胞化学方法能显示的酶，均可用于标记抗体，进行ICC染色，但实际上在ICC中所能用的酶并不多。现将常用的几种酶列于表4-1，供选用时参考。

表4-1 免疫细胞化学常用的酶

名 称    分 子 量    内 源 性    商 品
HorseerADIsh peroxidase(E.C.1,11,1,7)    40～45KD    +    有
Alkaline phosphatase (E.C.3,1,3,1)    80～120Kd    ++    有
Acid phosphatase (E.C.3,1,3,2)    100Kd    +++    有
Glucose oxidase    160～190kD    －    有
Sternberger(1986)指出，用于标记的酶应具备以下几点①酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察;②所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位;③较易获得的酶分子，有商品出售;④中性pH时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存1～2年活性不应改变，且酶的催化活性(Turnover)越高越好;⑤酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性;⑥被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。

其中，①②两点甚为重要，因为并非容易显示的酶均能形成不可溶性的复合物。一般认为，辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase , HRP)较佳，是zui常用的一种酶。HRP广泛分布于植物界，以植物辣根(西洋山嵛菜)的叶内含量zui丰富而得名。它是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合组成的一种糖蛋白，糖占16%～18(8条糖链分布在HRP分子表面)，分子量40kD，zui适pH5～5.5，zui适温度40～45℃; pH4～11，50℃以下均较稳定，易溶于水和58%以下的饱和硫酸铵溶液。酶的活性中心含铁卟啉，称辅基，zui大吸收光谱为403nm，而其余非活性的酶蛋白部分吸收光谱为275nm，HRP的纯度是用二者的光密度比值(Od 403/275)衡量，Reinheit Zahl (RZ)表示。一般认为，标记酶的RZ值为3.0左右，不应小于2.8，RZ值越小，酶的纯度越差，例如RZ值为0.6的酶，含非活性的酶蛋白量高达75%。对于纯度低、质量差的酶，需纯化后使用。

除HRP外，碱性磷酸酶(Alkaline phasphotase, ALP)和葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase, GOD)也较常用。ALP分子量约为HRP的2～3倍，zui适pH9.0～9.5左右，比较稳定，内源性ALP也较易消除，大部分均可被 (Levamisole,分子量240.8kD)抑制，但肠粘膜表面的内源性ALP活性不受影响。目前所用的ALP大多系由牛的肠粘膜提取制得，所以肠粘膜等呈强阳性反应。

ALPzui初是由Bulman等用于标记抗体的。选用不同的底物，可形成不同颜色的终产物，例如以萘酚(As-Mx)和快蓝(Fast Blue, FB)为底物，生成蓝色沉淀。用快红(Fast Red, FR)代替FB，形成红色不溶沉淀。与HRP/4-氯-1-萘酚(CN)或DAB形成的沉淀形成鲜明对比，但FB、FR等沉淀物溶于有机溶剂，不能进行脱水、透明等处理。据报告，利用新品红(New fuch-sine )显色，形成的红色沉淀产物不溶于有机溶剂，不褪色，轻度核复染后，可制成半*性保存标本。

GOD所催化的底物为葡萄糖，电子供体为对硝基四唑蓝(P-Nitroblue Tetrazolium),终产物为不溶性的蓝色沉淀，比较稳定。从理论上讲GOD较ALP、HRP为佳，因为哺乳动物组织内不存在内源性GOD，但其分子量较大，具有较多的氨基，在标记时易形成广泛的聚合，影响酶的活性，故GOD主要用于ICC双重染色和两种酶的放大技术。

(二)酶标抗体的制备(Boosma,DM, 1983)

酶标抗体与荧光色素标记抗体不同，它需借助桥-偶联剂的作用，将酶连结在抗体分子上。偶联剂是一种双功能试剂，具备3个基本特征：①偶联剂与抗体和酶之间的连结，必须是不可逆的，即借共价键连结;②偶联剂不应影响酶和抗体的活性;③不能因偶联剂的加入，使酶与组织成分了生非特异结合。

在HRP标记抗体中，常用的偶联剂有戊二醛、过碘酸钠及Maleimide等，现简介如下。

1.戊二醛标记法 戊二醛为制备各种酶标抗体zui常用的偶联剂。市售戊二醛往往含有戊二酸、丙烯释及戊二醛自身聚合本等杂质，故需纯化后使用。戊二醛的纯度用含杂质的二醛的单体戊二醛的OD比值表示，它们的zui大吸收光波长分别为235nm 和280nm，二者的OD比值(235/280)小于3时，制备酶标抗体的效果较好，大于3时，需经蒸馏或Sephadex G-10柱层析或活性碳吸附等处理，除去杂质后应用。其制备方法分一步法和两步法;基本原理相同，是使戊二醛的两个醛基之一与酶蛋白的赖氨酸结合，另一醛基与免疫球蛋白上的氨基结合，将酶连结于抗体上。

(1)一步法：将酶、抗体、戊二醛按一定比例混合，经透析除去标记物中剩余的戊二醛，制得酶标抗体。优点是简单省时，缺点是反应程度不易被控制，因为酶蛋白分子和抗体蛋白分子同戊二醛间的反应速率不同，抗体蛋白的氨基数远较HRP为多，与戊二醛反应快，因此在戊二醛的作用下，抗体蛋白易通过分子内和分子间的彼此交联，形成较大的聚合体，而与酶蛋白分子间的交联相应减少，影响酶的标记。据Nakane等推算，加入的HRP仅20%与抗体连结，标记率较低(约1%～5%)很难获得理想的酶标抗体。

(2)二步法：首先用过量的戊二醛与HRP反应(HRP：戊二醛为1：105)，以保证酶分子仅与戊二醛的一个醛基结合，另一个醛基游离;然后用层析法除去多余的戊二醛，制成活性HRP(HRP-戊二醛复合物)，再加入过量的抗体，使活化HRP上剩余的醛基与抗体蛋白分子上的氨基结合，制成酶标抗体。过量的抗体可以保证酶与抗体间均匀连结，避免酶本身聚合。根据所用的HRP与抗体(IgG)比例不同，酶标记率各异，平均为5%～25%。标记步骤如下：

①10～15mg HRP(RZ=3.0),溶解于0.2ml 1.25%戊二醛中(0.1mol/L磷酸缓冲液配制)，18h室温。

②透析或 Sephadex G-25柱层析(0.15mol/l NaCl平衡)，去除过量的戊二醛，收集活化HRP。

③浓缩活化HRP至10mg/ml左右，加入抗体5mg(1.0ml 0.15mol/L NaCl 溶解)。

④碳酸盐缓冲液(pH9.5)调整pH至9.0～9.5,使抗体与活化HRP结合，4℃24h。

⑤加入0.1ml赖氨酸缓冲液，阻断未反应的醛基，4℃，2h。

⑥用半饱和硫酸铵沉淀5次，对PBS透析24h，4℃，换3次PBS，除去硫酸铵(10000rpm/min,30min)。

⑦或用凝胶色谱法(Sephadex G-200/Sephacryl S-200) 等分离标记抗体。

注意：该方法要求HRP的RZ值在3.0左右，游离氨基较少，与戊二醛反应后，制成的酶标抗体大部分为单体;而RZ值小于2.8的HRP，含有较多的游离氨基，与戊二醛反应后，易形成多聚体，使方法的敏感性下降。

2.过碘酸盐氧化法 严格地讲，过碘酸钠(Sudium periodate)不是一种真正的偶联剂，其本身并非作为桥连结在抗体和酶之间，而是借助于过碘酸钠的氧化作用，将酶连结在抗体上。该方法仅适于含糖较丰富的酶(如HRP)的标记。我们知道，HRP分子的糖本身与酶活性无关，利用过碘酸钠氧化这部分糖分子内的-CH基，使之生成-CHO基，再与抗体蛋白的游离氨基反应，生成Shiff’s碱。此Shiff’碱在pH降低时呈可逆性解离，所以经氢硼化钠(NaBH4)还原，形成稳定的酶标抗体复合物(图4-1)。为防止生成的-CHO基与酶蛋白氨基自身交联，预先可用二硝基氟苯(Dintro-fluorobenzene)处理HRP，阻断分子内的ε-、α-氨基。

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HRP特异底物为H2O2,在分解H2O2过程中,与H2O2形成复合物,无电子供体存在时,反应不再进行,当电子供体存在时,迅速生成水,酶被还原,电子供体被氧化环化,形成苯乙胼聚合体(图4-2)。在酶反应部位，形成不溶性棕褐色沉淀，与组织对比清晰。

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图4-3 两步酶催化反应原理

二、非标记抗体酶法

由于酶标抗体存在一些缺点，例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性;②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法(Enzyme Bridge Method)和过氧化物酶抗过氧化物酶法(Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法)。现分述如下。

(一)酶桥法

1.基本原理 首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的*抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节 省*抗体的用量。

2.染色步骤 主要程序如图4-4

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一般HRP/抗HRP的克分子比达1.9时，可分装冷藏于-85℃冰箱，据报告如此冷藏的PAP复合物可保留14年之久，活性无改变。但稀释后的PAP复合物不稳定，4℃可保存2～3周。临用前配制。

【PAP复合物的特征】

PAP复合物的形成不同于其它抗原抗体反应，在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP，而大多数抗原抗体反应需要抗原过量才能形成可溶性复合物。PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论zui初加入的抗原抗体过量与否，zui终形成的PAP复合物其HRP/抗HRP之比绝大部分为3：2。应用离心沉降、液相扩散等方法分析表明：PAP复合物沉降系数为11.5s,分子量为400～430kD，由此可推算出酶与抗体之比为3：2，即每个PAP生命物由3个HRP分子和2个抗HRP抗体组成，呈五角形结构，3个角为HRP，另两个角为抗HRP抗体。采用H2O2-DAB染色，电镜下已经观察到PAP复合物五角形环状结构，直径平均21nm 。这种结构异常稳定。据报告PAP复合物的抗HRP抗体与HRP结合常数为108，在此可溶性复合物中，即使存在少量游离HRP，亦不影响其稳定性。

2.PAP染色原理及步骤

(1)原理：与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在与组织抗原结合的*抗体上，所不同的是PAP法将酶桥法的步骤3、4合并为1，用PAP复合物代替，即第三步用PAP复合物孵育切片，故称PAP法。PAP复合物中的抗HRP抗体和*抗体为相同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在*抗体上。

(2)染色步骤：主要步骤与酶桥法相似，如图4-5。

①切片准备及*抗体孵育前处理同间接法;切片与特异性*抗体孵育同酶桥法。

②用过量的桥抗体孵育，作用同酶桥法。

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图4-6 间接酶标抗体法

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图4-8 示假阴性：组织切片上结合过多的*抗体，两抗体间的距离d 恰好适于桥抗体的两个Fab段与之结合，无PAP复合物结合的位置

(5)桥抗体：也称连结抗体，它的两个Fab段具有相同的结构、性质及与抗原结合的能力。因此，当*抗体和PAP复合物中抗HRP抗体来自同一种属动物时，桥抗体能同时与上述两种抗体结合，起到桥的作用。为了确保桥抗体的两个Fab段之一与*抗体结合、另一个与抗HRP抗体结合，桥抗体需用高浓度。另外，在非标记抗体酶法中可用葡萄球菌蛋白A(SPA)代替桥抗体，进行ICC染色。SPA不受种属限制，应用范围广。

(6)PAP复合物：在PAP法及酶桥法中，特别强调*抗体和抗HRP抗体必须来自同一种属，桥抗体才能发挥桥的作用，将其连结在一起;但一些研究表明：*抗体和抗HRP抗体来自不同种属，连结抗体仍可作为桥，将二者连在一起。例如Erlandsen发现豚鼠IgG作为*抗体，可用羊抗兔IgG、兔PAP复合物显示之一。Grzanna(1982)根据这一报告，利用豚鼠抗DBH血清作*抗体，羊抗兔IgG为桥抗体，12例兔血清制得的PAP复合物中，仅3例染色较佳。这种*抗体和PAP复合物来自不同种属获得的阳性结果主要依赖于种属间的交叉反应。多数实验表明：抗体和种属交叉反应是有限的，也是不*的。故利用桥抗体进行ICC染色时，仍以*抗体和抗酶抗体来自同一种属为宜。