毕氏酵母感受态细胞制备及转化

1、毕氏酵母氯化锂转化法  
（1）试剂  
1MLiCl（用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释）  
50%PEG3350（SigmaP3640用去离子蒸馏水配制，滤膜过滤除菌，用较紧的盖子的瓶子分装）  
2mg/mlsalmonspermDNA/TE（10mMTris-Cl,pH8.0,1.0mMEDTA）-20℃保存  
注：醋酸锂对毕氏酵母无效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用；  
（2）感受态毕氏酵母的制备  
接种Pachiapastoris到50mlYPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108Cells/ml）；  
收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；  
重悬细胞于1ml100mMLiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；  
离心机zui大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul100mMLiCl溶液中；  
按50ul/管分装，立即进行转化；  
注：不要将感受态酵母菌冰浴；  
（3）毕氏酵母的转化  
煮沸1ml鲑鱼精DNA5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；  
将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；  
对于每一个转化，按以下顺序加入：  
50%PEG3350240ul  
1MLiCl36ul  
2mg/ml单链SalmonspermDNA25ul  
5～10ug/50ulH2O质粒DNA50ul