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士锋生物组织与细胞蛋白样品的制备

时间:2014/6/4阅读:810
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1.1 材料 
1.1.1 组织和细胞的来源: 
1.1.2 仪器设备 
机械组织匀浆器 
低温高速离心机 (>40,000 g) 
超速离心机 
超生细胞破碎仪 
超纯水装置 


1.1.3 试剂 
三氯醋酸 (TCA) 
丙酮 
二硫苏糖醇 (DTT) 
尿素 
CHAPS 
PMSF 
EDTA 
乙醇 
磷酸 
考马斯亮蓝R350 
抑肽素A 
亮肽素 

试剂纯度均应是分析纯或以上。

1.1.4 溶液配制 
(1) PBS: 
NaCl 8 g, KCl 0.2 g, Na2HPO4 1.44 g, KH2PO4,溶于800 ml水中,用HCl调pH至7.4,用纯水定容至1 L; 
(2) EDTA 储存液: 
18.61 g Na2EDTA·2H2O,溶于70 ml纯水中,用10 mol/L NaOH调节pH值至8.0 (约需2 g NaOH颗粒),定容为100 ml。可高压灭菌后分装备用; 
(3) 亮肽素储存液 (50 μg/ml,100×) 
10 mg/ml溶于水,-75℃保存;使用时配成50 μg/ml储液,-20℃保存; 
(4) 抑肽素储存液 (70 μg/ml,100×) 
1 mg/ml溶于甲醇,-75℃保存;使用时配成70 μg/ml储液,-20℃保存; 
(5) PMSF储存液 (10 mM, 100×): 
17.4 mg PMSF,溶于1ml异丙醇中,-20℃ 保存。 
(6) DTT 储存液 (1 M): 
0.31 g DTT溶于2 ml H2O中,-20℃ 保存 (DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理,可过滤除菌)。 
(7) 裂解液: 
Lysis buffer A 
(9 M urea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
组织与细胞蛋白样品的制备
Lysis buffer B
(7 M urea, 2 M thiourea, 4% w/v CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors) 
Lysis buffer C 
40 mM Tris-base (pH 9.5) in ultrapure H2O
Lysis buffer D
(8 M urea, 4% CHAPS, 40 mM Tris(base), 40 ml)
组织与细胞蛋白样品的制备
Lysis buffer E 
(5 M urea, 2 M thiourea, 2% SB 3-10, 2% CHAPS, 1% w/v DTT, 0.5% CA and a cocktail of protease inhibitors)
组织与细胞蛋白样品的制备
Lysis buffer F
100 μL SDS sample solution (1% w/v SDS, 0.375 M Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM DTT, 25% v/v glycerol)
●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。
(8) 蛋白酶抑制剂混合物

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