PCR引物设计及软件使用技巧

摘 要：本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。在pcr引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。
关键词：PCR；引物设计

To design PCR primers with oligo 6 and Primer Premier 5
Zhang Xinyu, Zhu Youkang, Gao Yanning
(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical sciences,Beijing,100021,China)
Abstract: The skill of PCR primer design with software is introduced in this paper. Based on the principal of PCR-primer design, the usage of two kinds of popular primer-design software was reviewed detailedly, including their merit, demerit and usage skills. It is recommended that to use Premier Primer 5 does the usual automatic primers search, but Oligo 6 primers analysis.
Key Words: PCR primer; design; usage skill;

自从1985年Karny Mullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研究中使用zui多、zui广泛的手段之一[1] ，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。

1. 引物设计的原则
引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用ΔG值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应[2] 。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2] 。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2] 。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件zui。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是zui邻近法(the nearest neighbor method) [6][7] 。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6] 。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。

摘 要：本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。在pcr引物设计原则的基础上，详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。
关键词：PCR；引物设计

To design PCR primers with oligo 6 and Primer Premier 5
Zhang Xinyu, Zhu Youkang, Gao Yanning
(Cancer Institute, Chinese Academy of Medical sciences,Beijing,100021,China)
Abstract: The skill of PCR primer design with software is introduced in this paper. Based on the principal of PCR-primer design, the usage of two kinds of popular primer-design software was reviewed detailedly, including their merit, demerit and usage skills. It is recommended that to use Premier Primer 5 does the usual automatic primers search, but Oligo 6 primers analysis.
Key Words: PCR primer; design; usage skill;

自从1985年Karny Mullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研究中使用zui多、zui广泛的手段之一[1] ，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。

1. 引物设计的原则
引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。
具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用ΔG值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：
1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应[2] 。
2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加[2] 。
3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2] 。
4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大[2][5]。
5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件zui。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是zui邻近法(the nearest neighbor method) [6][7] 。
6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（值不超过9），而5’端和中间ΔG值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6] 。
7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。
8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。