树突状细胞（dendritic cell,DC） 的体外制备

树突状细胞(dendritic cell,DC) 是一类具有树枝状突起的抗原呈递细胞，其分布广泛，由骨髓中的髓性多能干细胞发育而成，在免疫应答过程中至关重要。它是原发性混合淋巴细胞反应中的主要刺激细胞，可激活Th 细胞发生增殖反应，而且还能刺激产生TC 细胞。树突状细胞呈递抗原给T 细胞提供稳定的微环境。

基本原理
本文应用细胞因子GM-CSF 和IL-4 使血液中单核细胞分化成树突状细胞，并用IFN-α促进树突状细胞的成熟。
试剂和材料
● 新鲜的外周（肝素）抗凝血液
● 淋巴细胞分离液。无钙镁HanKs(CMF-HanKs)液
● 制剂：人重组GM-CSF(hrGM-CSF)。hrIL-4 hr IFN-α。
●培养液：
（1） RPMI1640 全培基：RPMI1640+10% 胎牛血清（ FCS、热灭活）+2mmol/LL-谷氨酰胺+100IU/ml 青霉素+100μg/ml 链霉素+1g/L 非必需氨基酸+1 mmol/L 丙酮酸钠+5×105 mol/L 2 巯基乙醇。
（2） RPMI1640/IL-4/GM-CSF:即RPMI 全培基+IL-4(40ng/ml)+GM-CSF(50ng/ml).
（3） RPMI1640/IFN-α:即RPMI 全培基+ IFN-α（1 ~ 10ng/ml）。

器皿及仪器
培养瓶（25 ml 和75 ml）CO2 孵箱、光学显微镜、血细胞计数器、垂直气流超净台、离心机等。

3、培基第3 天换液，轻轻吸去原培养液，加入等量含有IL-4 和GM-CSF 的新鲜1640 培氧液，继续置CO2 孵箱中培养。
4、促树突状细胞成熟：单核细胞经与IL-4 和GM-CSF 的共同孵育，7 天左右使其分化成树突状细胞，但并未成熟。此时轻轻吸去含有IL-4 和GM-CSF 的1640 培养液，更换等量的含有IFN-α的RPMI1640 培养液，继续置5%CO2 孵箱中，37℃培养，至第9 天时可获得成熟的树突状细胞。

质控与提示
1、细胞活性：用胎盼蓝拒染法检测，至少应有90%的细胞具有活性。
2、细胞分化能力检测：单核细胞开始培养时，细胞贴附于塑料培养瓶壁上，用抗CD14 荧光抗体标记检测，细胞纯度均应为90% ~ 100%，当用IL-4 和GM-CSF 孵育7 天和改用IFN-α孵育至第9 天时，单核细胞分化为树突状细胞并不断趋向成熟，此时细胞不再贴壁生长，也不再表达CD14 抗原；但能高水平表达MHC-Ⅱ类抗原和CD1а抗原。
3、许多种类的诱导剂都可用于人脊髓细胞转化成树突状细胞。
4、单核细胞，如来源于骨髓的CD34+细胞或来源于脐血的CD34+细胞等不同的始动细胞，均可用于树突状细胞的分化培养。
5、此项技术基于单核细胞贴壁而设计，也可用塑料培养袋培养，防止单核细胞的贴壁，但
分离方法要改变为沉降法。