上海晶抗生物猴破伤风抗体(Tetanus Ab)ELISA试剂盒通常采用 间接法 原理，用于定量检测猴血清、血浆样本中的破伤风抗体（IgG）水平。

一、检测原理

试剂盒微孔板已预包被破伤风类毒素（TT）抗原。

样本孵育：样本中的猴抗破伤风抗体与板上抗原特异性结合。

酶标二抗孵育：加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗猴 IgG 抗体，与已结合的抗体形成 “抗原 - 抗体 - 酶标二抗" 复合物。

显色：加入 TMB 底物，酶催化底物显蓝色；加终止液后变黄。

定量：450nm波长测 OD 值，OD 值与抗体浓度成正比。

二、试剂盒组成（通用）

预包被破伤风类毒素的 96 孔板

标准品（猴破伤风抗体，梯度浓度）

酶结合物（HRP - 抗猴 IgG）

样本稀释液、洗涤液（浓缩）

TMB 显色液、终止液

封板膜、说明书

三、标准操作步骤（SOP）

1. 实验准备

试剂盒、样本 平衡至室温（18-25℃）。

洗涤液用蒸馏水30 倍稀释备用。

标准品按说明书稀释（通常倍比稀释）。

2. 加样与孵育（一抗）

设空白孔、标准孔、待测样本孔、阴 / 阳性对照孔。

空白孔：100μL 样本稀释液。

标准 / 样本孔：100μL 稀释后标准品 / 待测样本。

封板，37℃孵育 60 分钟。

3. 洗涤（关键步骤）

弃液，每孔加350μL 洗涤液，静置60 秒后甩干。

重复洗板 3-5 次，最后在吸水纸上拍干。

4. 加酶结合物与孵育（二抗）

除空白孔外，每孔加100μL 酶结合物。

封板，37℃孵育 45-60 分钟。

5. 洗涤

同步骤 3，严格洗板 5 次，去除未结合酶标物。

6. 显色

每孔加TMB 显色液 100μL。

37℃避光孵育 15-20 分钟（显蓝色）。

7. 终止与读数

每孔加50μL 终止液（蓝色立转黄色）。

15 分钟内，酶标仪450nm测各孔 OD 值。

四、结果计算

标准曲线：以标准品浓度为 X 轴、OD 值为 Y 轴，用四参数 Logistic 拟合。

样本浓度：将样本 OD 值代入曲线，计算浓度（注意乘以稀释倍数）。

判定：高于临界值为阳性（有免疫力）；低于临界值为阴性（易感）。

五、注意事项

样本：血清 / 血浆无溶血、无脂血，-20℃保存，避免反复冻融。

温育：严格控温、控时，避光显色。

洗涤：洗板是降低非特异性背景、保证准确性的关键。

试剂：不同批次试剂不可混用。

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