上海晶抗生物牛β-乳球蛋白(β-LG)ELISA试剂盒测试 是一种基于双抗体夹心法的高灵敏度定量检测技术，用于精准测定牛奶、血清、生物样本等中的 β- 乳球蛋白含量。以下从原理、操作、样本处理、结果计算、注意事项全流程详解：

一、检测原理（双抗体夹心 ELISA）

固相包被：微孔板预包被高特异性抗牛β-LG单克隆抗体（捕获抗体）。

抗原结合：加入标准品 / 待测样本 → β-LG抗原与捕获抗体特异性结合。

检测抗体：加入HRP酶标记的抗牛β-LG 抗体（检测抗体）→形成 “固相抗体-抗原-酶标抗体" 夹心复合物。

洗涤：洗去未结合物质，降低非特异性干扰。

显色：加入TMB 底物 → HRP 催化底物呈蓝色；加终止液（2M H₂SO₄） → 蓝色转黄色。

读数：酶标仪450nm测吸光度（OD 值） → OD值与β-LG浓度成正比 → 标准曲线定量。

二、试剂盒核心参数（通用）

检测范围：0.156~10 ng/mL 或 1.56~100 μg/mL（依品牌 / 批次）

灵敏度：检测限 0.05~0.1 ng/mL

样本类型：牛奶、奶粉、血清、血浆、细胞上清、乳清液

反应时间：全程 2.5~3.5 小时

特异性：不与 α- 乳白蛋白、酪蛋白交叉反应

保存：2~8℃避光，有效期 6 个月

三、实验前准备

1. 自备器材

酶标仪（450nm 滤光片）

微量移液器（单道 / 排枪）、枪头

洗板机 / 手动洗板、离心管、涡旋仪

蒸馏水 / 去离子水

2. 试剂平衡

试剂盒从 2~8℃取出，室温平衡 20~30 分钟再开封

浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释（如 1mL 浓缩液 + 29mL水）

四、标准操作流程（96 孔板）

1. 加样（标准品 + 样本）

设空白孔、标准孔、样本孔

标准品：梯度稀释（如 10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156 ng/mL）

每孔加 100μL 标准品 / 样本 → 封板膜 → 37℃孵育 60 分钟

2. 洗板（关键步骤）

弃液 → 每孔加满洗涤液 → 静置 30 秒 → 弃液 → 拍干

重复洗板 5 次 → 除游离蛋白

3. 加酶标抗体

每孔加 100μL HRP标记检测抗体 → 封板 → 37℃孵育60分钟

4. 洗板

同步骤 2 → 洗板 5 次 → 拍干

5. 显色

每孔加 90μL TMB 底物 → 37℃避光孵育 15~20 分钟 → 呈蓝色

6. 终止 + 读数

每孔加 50μL 终止液 → 蓝色立即变黄

10 分钟内酶标仪 450nm 测 OD 值

五、样本处理（关键）

1. 液态奶（生乳 / 巴氏奶）

取 100μL → 用1:10000 倍稀释（避免浓度过高）

离心：10000×g，10 分钟 → 取上清待测（去脂肪 / 杂质）

2. 奶粉

1g 奶粉 + 10mL 蒸馏水 → 充分溶解 → 离心 → 取上清 → 1:10000 稀释

3. 血清 / 血浆

样本 1:100~1:1000 稀释 → 直接检测

4. 热处理样本

高温（≥75℃）会使 β-LG 变性 → 抗体识别表位改变 → 结果偏低 → 实验需注明热处理条件

六、结果计算

校准曲线：以标准品浓度为 X 轴、OD 值为 Y 轴 → 四参数 Logistic 拟合

样本浓度：样本 OD 值代入曲线 → 计算浓度 × 稀释倍数

正常参考：生牛乳 β-LG 2~4 mg/mL

七、常见问题与质控

1. 高 OD 值（颜色过深）

原因：样本浓度过高 → 解决：加大稀释倍数

2. 低 OD 值（颜色浅）

原因：孵育不足 / 洗板过度 / 试剂失效 → 解决：控温、规范洗板、查有效期

3. 复孔差大（CV＞10%）

原因：加样不准 / 洗板不均 → 解决：排枪加样、充分洗板

4. 空白孔高（非特异显色）

原因：污染 / 封闭不足 → 解决：换枪头、洁净环境、严格洗板

八、应用场景

乳制品质量控制（原料奶 / 成品 β-LG 含量）

热加工评估（UHT / 巴氏杀菌对 β-LG 影响）

过敏研究（牛奶过敏原定量）

动物乳腺功能、乳清蛋白分离纯化监测
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