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上海通蔚实业有限公司
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阅读:151发布时间:2019-7-12
细胞转染界说:将外源分子如DNA RNA等导入真核细胞的技能。
瞬时转染:外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞可存在多个拷贝数,发生高水平的表达,但一般只继续几天,多用于发起子和其他调控元件的剖析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染功率较高,在转染后24-72h内剖析成果,常常用到一些报告系统如荧光蛋白,β半乳糖苷酶等来协助检测。
安稳转染:外源DNA既可以整合到宿主染色体中,也或许作为一种游离体存在。虽然线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小,一般需求一些选择性标记重复挑选得到安稳转染的同源细胞系。
方法及特征:
化学法:磷酸钙法、DEAE-右旋糖苷法、阳离子脂质体法
物理法:电穿孔法、显微注射法、biolistic颗粒传递法
病毒介导法:逆转录病毒、腺病毒
阳离子脂质体法:带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团构成复合物被细胞内吞。
特征:简单通用,适用性广,转染功率高,重复性好,但转染时需除血清,转染功率随细胞类型改变大。
脂质体法因为脂质体复合物与贴壁细胞的触摸机会远大于悬浮细胞,所以贴壁比悬浮转染功率要高。悬浮细胞建议运用电穿孔法。
电穿孔法:运用高压电脉冲对细胞膜的搅扰,使其构成利于核酸进入的微孔。
特征:需求特定仪器,适用性广,除了质粒外,还可转染大的基因组,细胞致死率高。
逆转录病毒(RNA):通过病毒中膜糖蛋白和宿主细胞表面的受体相互效果进入宿主细胞,之后反转录酶发起组成DNA并随机整合到宿主基因组中。
特征:安稳转染,可用于难转染的细胞、原代细胞,体内细胞等,但带着基因不能太大。
腺病毒(双链DNA):先和细胞表面的受体结合,继而在αV整合素介导下被细胞内吞。
特征:可用于难转染的细胞。
影响转染的要素:
1、血清 血清影响复合物的构成,降低转染功率
阳离子脂质体和DNA的*量在运用血清时会有所不同,因此想在转染培养基中参加血清时要进行条件优化。大部分细胞可以在无血清培养基中几个小时内保持健康,关于对血清短少比较活络的细胞,可以运用OPTI-MEM I培养基。关于对血清短少比较活络的贴壁细胞,建议运用LIPOFECTAMINE 2000。
2、抗生素 比如*和*,是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般关于真核细胞无毒,但阳离子脂质体试剂添加了细胞的通透性,使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性,导致转染功率低。
3、细胞代数 转染前细胞通过1-2次传代保证细胞成长旺盛简单转染,留意贴壁细胞一旦长满就不好转染。
4、细胞铺板密度 一般转染时,贴壁细胞密度为70%-90%,悬浮细胞密度为2*10^6--4*10^6细胞/ml时效果较好。保证转染时细胞没有长满或处于静止期。铺板细胞数目的添加可以添加转染活性和细胞产量。
5、DNA质量 DNA质量对转染功率影响非常大。一般的转染技能依据电荷吸引原理,假设DNA不纯,如带少数的盐离子,蛋白,代谢物污染都会明显影响转染复合物的有效构成和转染的进行。
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