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规格 | 50T/100T | 仪器 | 分光光度计/酶标仪 |
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运输 | 常温/2-8℃ | 保质期 | 三个月 |
品牌 | 合肥莱尔生物科技有限公司 | 订购方式 | 联系客服 |
保存 | 详情见说明书 | 货期 | 现货 |
测定意义:
SDH(EC 1.3.5.1)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。SDH 是线粒体的一种标志酶,位于线粒体内膜上的一种膜结合酶,是连接呼吸电子传递和氧化磷酸化的枢纽之一。此外,为多种原核细胞产能的呼吸链提供电子。
测定原理:
SDH 催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸,脱下的氢通过吩嗪二甲酯硫酸(PMS)传递还原 2,6- 二氯酚靛酚(DCPIP),并且在600nm 处具有特征吸收峰,通过600nm 吸光度的变化,测定2.6-DPIP的还原速度,代表 SDH 酶活性。
自备实验用品及仪器:
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:100mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:20mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:1.5mL×1 支,-20℃保存;
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存;
试剂五:粉剂×1 支,-20℃保存;
琥珀酸脱氢酶(SDH)检测试剂盒样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆 600g,4℃离心 5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。
④ 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的SDH(此步可选做)。
⑤ 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W, 超声 3 秒,间隔 10 秒,重复 30 次),用于线粒体 SDH 活性测定。
测定步骤和加样表:
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 600nm,蒸馏水调零。
琥珀酸脱氢酶(SDH)检测试剂盒2、样本测定
(1) 在试剂四中加入 18mL 蒸馏水充分溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(2) 在试剂五中加入 1mL 蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;
(3) 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μ L 样本、10μ L 试剂五和 180μ L 试剂四,混匀,立即记录 600nm 处 20s 时的吸光值A1 和 1min20s 后的吸光值 A2,计算 Δ A=A1-A2。
SDH 活性的计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。SDH 活性( nmol/min /mg prot )= [Δ A×V 反总÷ ( ε ×d ) ×109]÷(Cpr×V 样)
÷T=952×Δ A÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
SDH 活性(nmol/min/g 鲜重)=[Δ A×V 反总÷(ε ×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)
÷T=192×Δ A÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。SDH 活性( nmol/min/104 cell )=[Δ A×V 反总÷( ε ×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.385×Δ A
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε :2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cm; d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL; T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
琥珀酸脱氢酶(SDH)检测试剂盒b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。SDH 活性( nmol/min/mg prot )= [Δ A×V 反总 ÷ ( ε ×d ) ×109]÷(V 样 ×Cpr)
÷T=1904×Δ A÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义:每g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。
SDH 活性( nmol/min/g 鲜重)= [Δ A×V 反总÷ ( ε ×d ) ×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=384×Δ A÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。SDH 活性( nmol/min/104 cell )=[Δ A×V 反总÷( ε ×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.77×Δ A
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε :2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数,2.1×104 L / mol /cm; d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,0.202 mL; T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万
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