酶联生物给您讲解ELISA试验检测的质量分析

ELISA方法现在已经被广泛的应用于各种抗原和抗体测定。抛开试剂盒本身质量外，我们在实验中也有很多因素都会影响试验的正常结果。其中最常出现的问题是显色淡，灵敏度偏低、重复性不佳、假阳性结果和假阴性结果，不管出现什么样的结果都会直接影响我们的实验结果。下面来分析ELISA实验非正常检测结果产生的常见原因，并分析其解决办法，以提高检测质量。

1、方法学的影响

ELISA 测定模式包括以下几种: 双抗体夹心法、间接法、双抗原夹心法、IgM 抗体捕捉法、竞争抑制法, 其中竞争抑制法因受操作时差所引起的竞争等因素的影响, 结果重复性较差, 质量较难控制。

2、试剂因素

试剂的选择　检测的原理均基于抗原抗体反应。由于该反应过程受多种因素的影响, 如普遍存在基质效应、交叉反应等, 因而检测结果难以溯源, 不同方法、不同试剂之间甚至同一试剂不同批号间结果均缺乏可比性。试剂质量在很大程度上决定了检测的水平, 因此在引入新项目之前必须对试剂进行严格的评估。试剂的评估有以下几个步骤: (1) 确定开展该项目的必要性; (2) 了解该项目现有的检测方法和原理; (3) 在了解试剂的组成基础上选择多家试剂盒进行比较,判断标准参考方法或参考物质, 其次为临床的满意度及机构的报告如各级室间质量评价、CDC 报告等; (4) 定期对检测结果进行追踪反馈直至最终认可该试剂。

3、样本因素

标本干扰因素包括内源性干扰因素和外源性干扰因素,前者包括类风湿因子、补体、异嗜性抗体、自身抗体等, 后者包括标本溶血、标本被污染、标本贮存时间过长、标本凝固不全、冷冻标本的反复冻融等。其中外源性干扰因素是我们在检测过程中可以避免也是必须避免的因素, 而避免内源性因素的干扰则主要通过选择合适的试剂盒。在临床中遇到少见的疑难病例时应当考虑到内源性干扰因素的存在。以下对外源性干扰因素进行简要说明:

标本溶血　要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团, 其具有类过氧化物的活性, 因此, 在以辣根过氧化物酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 为标记酶的ELISA 测定中, 如果血清标本中血红蛋白浓度较高, 则其就很容易在温育过程中吸附于固相, 从而与后面加入的底物反应显色。

ELISA 操作步骤复杂, 操作不当将引起较大的误差。以下叙述各个步骤中的影响因素。加样器是一种比较精密的工具, 其在长时间使用时会因机械磨损或者推动杆内附着血痂等原因造成加样不准, 尤其是对于样本量较大的临床实验室, 因此必须定期对加液器进行维护和校准。每次加不同的标本时均需更换吸嘴, 以免发生交叉污染。加样时速度不可太快, 避免将标本加在孔壁上部, 并注意不要溅出或产生气泡。加样时还应当注意操作时差对结果的影响, 操作时差是指加入标本、试剂及混匀时间的差异。操作时差在每个实验中都存在, 尤其是手工操作, 日常检测标本多达几百个,从加入第一个标本到最后一个标本, 需几十分钟, 加入试剂及混匀等均存在着前后时间差异, 使抗原抗体反应和酶促反应时间不一致, 操作时差对竞争法检测的结果影响更大, 在加酶结合物和底物时可用定量多道。