古朵生物：ELISA标准曲线绘制的注意事项

　　制作ELISA标准曲线是ELISA实验中的重要步骤，很多人都不知道如何制作，其实标准曲线的制作很简单，下面就跟随古朵生物技术小编一起来看看ELISA标准曲线怎么制作吧!

　　在ELISA实验结束后，我们得到的是经酶标仪得出的标准品以及样本的OD值。其中，标准品的浓度已知，我们可以利用标准品的OD值及其相对应的浓度，以 OD值为横坐标，浓度为纵坐标，做一条标准曲线，并用公式表示出来。这样，我们把样本的OD值以X值代入，便可求出Y值，即样本浓度。

　　一、做标准曲线样品检测时有几个问题需要注意：

　　1、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的，所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事，否则后面的实验结果无从谈起。

　　2、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度，并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度，即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内，包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线，尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段，即曲线几乎成直线的范围内。

　　3、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度，这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。

　　4、检测标准样品时，应按浓度递增顺序进行，以减少高浓度对低浓度的影响，提高准确性。

　　5、标准曲线的样品数一般为7个点，但至少要保证有5个点。

　　6、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动，但一般来说，相关系数R至少要大于0.98，对于有些实验，至少要0.99甚至是0.999.

　　二、选择什么方程去拟合

　　用于免疫检测的所谓“标准曲线"其实称为拟合曲线比较合适。免疫检测时标准点(可以是倍比稀释的，也可以不是)浓度如果和相应的吸光度(OD)值如果能够呈现直线关系当然是理想的了，这时可以通过EXELL等获得拟合曲线，进而推算出样品的浓度值。但做免疫检测很少能够有这么理想的情况，标品浓度和相应OD值往往是“S"型的曲线关系，这时就不能用直线拟合的方式了，而对拟合方法进行选择就是必要的了。

　　关于标准曲线的拟合方式，直线、二次曲线、三次曲线、指数、对数等虽都可用于ELISA及其它生物学反应中的曲线拟合，但都只适用于曲线的一部分，有的适用于前半段，有的适用于后半段，有的适用于中间一段，而Logistic曲线则对曲线的全部都有较好的适用性。当然，如果用于定量，还是在中间一段较好。这些方法虽然没有一种方法可以通用，但也都可以用。关键在于你的标准曲线做到了S形的哪一部分，你想检测的样品浓度在曲线的哪一部分。在S曲线的低浓度部分可以用乘幂方程很好的拟合，中低浓度部分可以用直线方程，中间部分可用对数方程，而中后段可用四参数。

　　目前国际上流行的免疫检测拟合方式是“四参数逻辑拟合"，用这种拟合方式往往能够比较精确的反映浓度和吸光度的曲线关系，从而进一步比较正确的获得样品中待测物质的浓度值。

　　其实，在一个长的区间内，Logistic应该都能拟合得较为理想。但并不是说它就是万能的。事实上不仅是ELISA，其它很多生物学反应都是S形曲线，也都可以用Logistic曲线拟合。但建模型是一回事，而用它来定量是另一回事。如果用来定量，S形曲线的中间段(较陡处)是比较好的，而两端的平坦部分计算误差会大，有时甚至会很大。

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