上海古朵生物科技有限公司

三种染色方式下四种核酸染料的灵敏度比较

时间:2020-5-12阅读:1486
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    1.3.2 染样品法 同时制备四块不加染料的1%琼脂糖凝胶。待凝胶冷却凝固后,放入同一电泳槽中。将分别将0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng及50 ng的DL 15 000+2 000与4种染料混合,避光10 min.然后于不同泳道中加入。使用5V/cm的电压进行电泳,zui后用凝胶成像系统观察拍照。

    1.3.3 后染法 同时制备四块不加染料的1%琼脂糖凝胶。待凝胶冷却凝固后,放入同一电泳槽中。于不同泳道中分别加入0.5 ng、1 ng、2 ng、5 ng、10 ng、20 ng及50 ng的DL 15 000+2 000.使用5V/cm的电压进行电泳。电泳后将凝胶分别浸入用1×TAE稀释的4种不同染液中。按照说明书要求,GoldViewna II、GoldView、DNA Green及EB避光染色的时间分别为60 min、30 min、30 min、30 min.DNA Green染色完毕后还需用1×TAE脱色30 min.zui后用凝胶成像系统观察拍照。

    2 结果与分析

    2.1 染胶法

    染胶法的结果表明四种染料使用该法的灵敏度均zui高,其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为0.5 ng;EB能检测到的DNA含量约为1 ng;GoldView与DNA Green能检测到的DNA含量约为2 ng.

    2.2 后染法

    后染法的结果表明四种染料使用该法的灵敏度低于染胶法。其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为1ng;EB能检测到的DNA含量约为2 ng;DNA Green与GoldView能检测到的DNA含量约为5 ng.图2 使用后染法比较4种核酸染料染色DNA的灵敏度

    2.3 染样品法

    染样品法的结果表明四种染料使用该法的灵敏度zui低。其中GoldViewna II能检测到的DNA含量约为2 ng;EB与DNA Green能检测到的DNA含量约为5 ng、GoldView能检测到的DNA含量约为10 ng.

    3 讨论

    GoldViewna II是国内近年来推出的新型核酸染料,与SYBR Green I同属花青类染料。SYBR Green I是几年前推出的一种高灵敏度[3]且不具有强致突变性[4]的核酸染料,但由于其高昂的价格限制了它的广泛使用。上述实验表明GoldViewna II的灵敏度高,同时具有花青类染料不具强致突变性的优点,价格也比SYBR Green I便宜数倍。虽然其稳定性不如EB[3]且反复冻融效果变差,但只需要-20℃避光保存和分装使用即可。

    DNA Green是近才推出的新型核酸染料。它的灵敏度与EB相当但背景略高于EB,但该染料的价格比GoldViewna II还便宜且稳定性比较好,4℃避光保存即可。

    GoldView是国内较早使用的新型核酸染料,它的灵敏度比EB略低且背景太高。不适合做微量的DNA检测。但该染料稳定性也比较好,4℃避光保存即可,价格是这三种染料中*的。

    这些新型核酸染料均可替代EB广泛使用,从而减少大量使用EB对人体的危害和对环境的污染。使用者可以根据自己的需要选择合适的染料。

    染色方法比较可以看出:染胶法的检测灵敏度zui高;后染法的检测灵敏次之;染样品法的检测灵敏度zui低,不适合做微量DNA检测。此外,后染法用于新型核酸染料很不合适。花青类染料用于后染法需要将染料用1×的电泳缓冲液稀释到聚丙烯容器中,在避光条件下该溶液zui多可以在24小时内被使用且染2~3块凝胶后其灵敏度会降低,结果略。这样的结果导致染料的巨大消耗,成本太高。DNA Green用于后染的工作浓度为10×,也就是染料用量提高10倍即成本增加10倍,而且在染色半小时后,由于其高背景还需要脱色半小时,延长了实验时间。既往有研究推荐使用后染法的原因是染色的DNA带型平直不扭曲[2]。我们的实践经验得出,电泳时控制合适的电压和上样量,新型核酸染料使用染胶法也能达到同样效果。故使用新型核酸染料染色DNA时推荐采用染胶法。

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