Caspase 8荧光法检测试剂盒(AFC)-荧光法-上海邦景实业有限公司

货号	BJ-01X6373

中文名称：Caspase 8荧光法检测试剂盒(AFC)

英文名称：Caspase-8 Fluorescence Metric Assay

产品规格：20T|50T|100T

产品货号：BJ-01X6373

本试剂盒适用于培养细胞及新鲜组织Caspase-8 检测。Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中Caspase-8 为关键的执行分子，与DNA 断裂、染色质凝聚和凋亡小体形成有关。Caspase-8 在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段，它被激活，活化的Caspase-8 由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，终导致细胞凋亡。Caspase-8 荧光检测试剂盒就是将Caspase-8 序列特异性的多肽偶联至发色基团。当底物被Caspase-8 剪切后，发色基团即游离出来，可通过荧光酶标仪测定其荧光强度（激发波长=485nm,发射波长=535nm）。

注意事项

1. Caspase-8 Substrate 避光保存及使用。

2. 对某些凋亡诱导剂引起的细胞凋亡可能存在非依赖于Caspase-8 活化的机制，这种情况时利用本试剂盒检测Caspase-8 活性无明显改变，需要考虑凋亡机制中的其他信号通路。

3. 细胞数量需达到3~5×106 个或新鲜组织50~100mg，以便能达到测定需要的100~200μg 蛋白的要求，因为Caspase-8 的活性与细胞裂解液的蛋白含量有关，如测定的RFU 值偏低，可以通过适当延长反应的时间，如果值还是不高，可通过增加细胞数量或组织量的方法来提高蛋白量。

细胞培养操作规程：

一．培养基及培养冻存条件准备：

1）准备F-12K培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。

2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。

3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。

二．细胞处理：

1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。

2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。

QQ截图20220509112004.png

细胞培养方法：

1、细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%（T25瓶），使覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。

2、细胞复苏：

①将冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4-5ml培养基混匀。

②在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清,加1-2ml培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。

3、细胞冻存：待细胞生长状态良好时进行细胞冻存保种

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次，加入1mL 0.25%（T25瓶）

②1-2min后，显微镜下观察细胞，大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入*培养基终止消化；

③将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清，加1ml冻存液重悬细胞；

④将冻存管放入程序降温盒，放入-80℃冰箱，4小时后将冻存管转入液氮罐储存。

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操作规程

1、在96孔板加入细胞100μL/孔，通常细胞增殖实验每孔加入100微升2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100微升5000～10000个细胞（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。置37℃ 5%CO2细胞培养箱培养24小时.

2、.加入适当浓度的0～10μL 受试化合物。

3、将96孔板在37℃，含5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中孵育适当时间。

4、将5×MTT 用稀释液稀释成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小时，使MTT 还原为甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板摇床摇匀。

7、酶标仪在570nm 波长处检测每孔的光密度（如无570nm 滤光片，可以使用560-600nm 的滤光片）。

8、结果分析

a、细胞的存活率：将各测试孔的OD 值减去本底OD 值（*培养基加MTT，无细胞）或空白药物孔OD 值（*培养基加受试药物的不同稀释度加MTT，无细胞），各重复孔的OD 值取平均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T 为加药细胞的OD 值，C 为对照细胞的OD 值。细胞存活率% =（加药细胞OD/对照细胞OD）×100

b、求出T/C = 50% 时的药物浓度(IC50)及T/C = 10%时的药物浓度(IC90)